窄宿主干酪乳杆菌表达系统的研究与应用

Intestinal microbes are highly related to animal health. Probiotics could dramatically improve the health performance of animals by changing the composition of intestinal microbiota, inhibiting pathogens and as living cell vaccines. Safe probiotic strain provide a ideal vector for intestinal health research. In this study, the host-defined plasmid expression system were constructed based on plasmid pMC11 derivative plasmids of Lactobacillus casei, and expression pattern of heterologous protein, secretion, membrane anchoring, surface anchoring and intracellular expression will be created. The common expression system could be a fundermental and practical vector for living cell vaccine delivery system. Simutaneously, based on mouse model, study on recombinant L. casei in situ and intestinal viability, specific immunity and influence on intestinal microbiota could be vital for industrial application.

肠道微生物与动物健康关系密切。益生菌通过调节肠道菌群，抑制有害微生物，以及作为活菌疫苗防控疾病，可以极大的提高动物健康水平。安全的益生菌是肠道健康研究的良好载体。本研究以干酪乳杆菌为目标，构建窄宿主表达系统。将来自干酪乳杆菌的质粒pMC11改造的衍生质粒，通过对组成型和诱导型启动子、信号肽的深入研究，创建外源蛋白在干酪乳杆菌中分泌、膜锚定、表层蛋白锚定以及胞内积累等多途径表达的通用型干酪乳杆菌表达系统，为活菌疫苗载体提供一个可行的应用平台。同时，用小鼠模型对重组菌在肠道的活性、定位，蛋白表达以及引起的免疫应答和微生物种群的变化进行研究。充分评估干酪乳杆菌的益生作用以及作为活菌疫苗载体的前景。

最新研究表明，益生菌可以作为活载体深入肿瘤核心，通过表达特殊的抗肿瘤分子药物来进行定向抗癌。这些应用的基础建立在活菌表达系统之上，特别是具有自主知识产权的成果，对我国在生物工程应用领域的安全具有不可替代的作用。本研究以干酪乳杆菌为目标，构建窄宿主表达系统，将来自干酪乳杆菌的质粒进行分析改造的衍生质粒，实现外源蛋白在干酪乳杆菌中分泌、膜锚定、表层蛋白锚定以及胞内积累等多途径表达的通用型干酪乳杆菌表达系统，为活菌疫苗载体提供一个可行的应用平台。同时，用小鼠模型对重组菌在肠道的活性、定位，以及引起的免疫应答和微生物种群的变化进行研究。研究结果：通过构建表达质粒，测试水解酶、细胞因子、生长激素、病毒表面抗原在干酪乳杆菌中分泌、锚定表达的情况，发现分泌载体和锚定载体能很好的表达甘露聚糖酶，干扰素alpha，而S层融合表达更好的表达细胞因子EGF、乙肝表面抗原alpha。对于病原菌巴氏杆菌的膜蛋白ompH、ompA则无法表达，对肠病毒EV71-VP1衣壳蛋白也无法实现表达。作为拓展研究，本课题建立了植物乳杆菌表达系统，并对其宿主范围、外源蛋白表达进行了研究，作为干酪乳杆菌表达系统的完善和补充。当前的研究表明，益生菌作为活菌载体具有良好的应用前景，值得进一步努力揭示表达机理，并对其膜锚定表达进行专门的研究，以期实现多价锚定表达和定向应用。