马鲛鱼肌原纤维蛋白氧化及其对转谷氨酰胺酶交联作用影响机制研究

Protein oxidation of mackerel muscle occurs frequently during preservation and processing, leading to negative effects on raw material and final products. Previous researches suggested that myofibrillar protein (MFP) oxidation caused the deterioration of gel properties while others found that appropriate oxidation could promote its gel forming ability. There is no systematic research focusing on the laws and mechanisms of fish muscle protein oxidation so far, neither the effects of microbial transglutaminase on oxidized fish MFP nor the mechanisms. By using Fenton model, firstly, the study will investigate the chemical changes in amino acids and the changes in protein secondary and third structure of MFP suffering different levels of oxidation, so as to understand its oxidative features and laws. Secondarily, carbonylation derivatives AAS and GGS will be measured together with a proteomic analysis of carbonylized proteins in oxidized MFP to expose the mechanism of MFP carbonylation. To better understand the cross linking model of oxidized MFP, electrophoresis analysis of MFP digested with chymotrypsin will be performed. Finally, the cross linking effect and style of transglutaminase on MFP receiving different levels of oxidation will be studied in order to explain the mechanism of oxidation influence on transglutaminase effect on MFP. This study aims to provide to theoretical reference and guide for better use of mackerel protein resource.

马鲛鱼贮藏加工中易发生蛋白质氧化，严重影响了原料和最终产品品质。研究表明，肌原纤维蛋白的氧化会导致凝胶特性的劣化，也有研究表明适度的氧化有利于凝胶形成。目前，鱼肉蛋白氧化的规律和机理尚未有系统性研究，而转谷氨酰胺酶对氧化鱼类肌原纤维蛋白的作用效果和机制未见报道。本课题拟采用Fenton模型，首先研究不同氧化程度马鲛鱼肌原纤维蛋白的氨基酸化学变化和蛋白质二、三级结构变化，明确其氧化特征与规律。其次，研究羰基化特征衍生物AAS和GGS氧化过程中的变化规律，并采用蛋白质组学方法分析羰基化蛋白的种类和丰度，揭示肌原纤维蛋白的羰基化机理。同时，采用糜蛋白酶电泳分析不同氧化程度肌原纤维蛋白的交联模式，探讨氧化对交联模式的影响机制。最后，研究不同氧化程度肌原纤维蛋白在转谷氨酰胺酶作用下的交联效果和形式，阐明氧化对马鲛鱼肌原纤维蛋白的转谷氨酰胺酶作用影响机理，为合理加工利用马鲛鱼蛋白资源提供理论依据。

马鲛鱼是我国常见经济鱼种，多应用于凝胶食品制作。其富含各类氧化因子，易引起蛋白质氧化，导致蛋白质结构和凝胶特性的变化。认知鱼蛋白氧化规律及其对凝胶特性的影响，并探究控制鱼蛋白质氧化具有重要的理论与生产意义。.首先采用Fenton氧化体系，研究马鲛鱼MFP在不同氧化强度下的氨基酸化学变化和蛋白质结构变化及氧化交联形式。发现氧化MFP α-螺旋结构和巯基下降伴随羰基和二酪氨酸上升，同时表面疏水性在1 mM H2O2轻微上升。肌球蛋白重链氧化中减弱伴随聚合物产生。1 mM H2O2氧化4 h MFP G’上升而16 mM H2O2下MFP G’下降。MTG处理后，轻度氧化(1 mM H2O2, 2 h) MFP G′比重度氧化(16 mM H2O2, 2 h)高，表明氧化对MFP理化性质和凝胶性质有显著影响。.进一步研究不同盐浓度下MFP氧化规律。发现巯基、羰基含量都随时间呈线性关系变化，0.6M NaCl下二者减少或上升速率最大，0.4M NaCl变化速率次之，最后为0.2M NaCl。随盐浓度增加粒径峰右移，0.6M NaCl最大。重度氧化0.6M NaCl下MHC随时间减少量最大。0.2M NaCl MFP溶解度低G’最低。0.4M NaCl下MFP的G’中度氧化最大，0.6M NaCl的MFP G’与氧化程度无关，但都高于未氧化组。.最后研究了没食子酸（GA）参与下MFP的氧化规律。发现5 μmol/g GA 稳定巯基和二级结构而125 μmol/g GA 导致巯基大量耗损，并降低α-helix结构。125 μmol/g GA产生更多蛋白多酚聚集物，并伴随MHC的显著下降。125 μmol/g GA 添加组自由基含量显著高于其他组，自由基峰宽显著窄于对照组。与对照组相比，5 μmol/g GA添加组G’升高，而125 μmol/g GA添加组G’降低。研究证实高浓度GA降低MFP凝胶性能，低浓度则促进凝胶改善。.项目研究揭示了鱼肉MFP羟基自由基氧化的基本规律和机制，明确了盐浓度对氧化进程的干涉效应，阐明了GA参与下的MFP氧化规律和凝胶特性变化。研究丰富了蛋白质氧化基础理论体系，同时为蛋白质、自由基与多酚相互作用理论提供了新证据，拓展蛋白质氧化的多元化理论体系。项目成果为利用蛋白质氧化调控鱼肉凝胶食品品质提供了理论依据，为开发鱼类凝胶食品绿色加工技术提供了支撑，