嗜热糖苷酶Fpendo5A转化稀有人参皂苷的选择性机制研究

Ginsenosides are the principal components responsible for the pharmaceutical activities of ginseng. The minor ginsenosides, which are more pharmaceutically active, can be produced via the hydrolysis of the sugar moieties in the major ginsenosides using acid hydrolytic, heating, microbial, and enzymatic transformation techniques. The enzymatic method has a profound potential for ginsenoside transformation, owing to its high specificity, yield, and productivity, and this method is increasingly being recognized as a useful tool in structural modification and metabolism studies. In this project, several methods such as molecular modelling, isothermal titration calorimetry, mutagenesis, MS/MS, and structural biology are combined to explore the selective mechanism of biotransformation of ginsenosides by thermophilic glycoside hydrolase Fpendo5A. Our results would highlight the importance of biotransformation of ginsenosides using glycosidase. Also promote the industrialization process of the rare ginsenoside and achieve the minor ginsenoside molecules in clinical application as soon as possible.

人参皂苷是人参药用的有效成分。稀有人参皂苷具有很高的药用价值和应用前景，并可通过酸水解、加热、微生物或酶法水解主要人参皂苷末端糖基而获得。生物酶法由于具有高特异性、高收率和可生产性，被认为是制备稀有人参皂苷最具有潜力的方法。本项目将利用计算生物学技术，创新性的采用简化的皂苷模型完善达玛烷型四环三萜皂苷同糖苷酶Fpendo5A的酶-底物复合物结构模型研究；利用等温滴定量热法测定模拟物同Fpendo5A的酶-配体相互作用情况；构建关键氨基酸残基突变体，采用串联质谱技术快速鉴定和检测突变体对不同皂苷底物的转化效率和糖苷产物结构；开展对Fpendo5A的结晶学和结构生物学研究。通过本项目的实施，将开拓糖苷酶转化稀有人参皂苷在选择性机制方面的研究；推动稀有人参皂苷的工业化进程；尽早实现稀有人参皂苷等一系列有机生物活性分子在临床中的应用。

人参皂苷是人参药用的有效成分。稀有人参皂苷具有很高的药用价值和应用前景，并可通过酸水解、加热、微生物或酶法水解主要人参皂苷末端糖基而获得。其中，生物酶法由于具有高特异性、高收率和可生产性，被认为是制备稀有人参皂苷最具有潜力的方法。本项目中运用分子生物学技术克隆、表达、纯化了来源于嗜热菌Fervidobacterium pennivorans DSM9078的嗜热内切纤维素酶Fpendo5A，并运用蛋白质晶体学的技术进行结晶，最终使用X-射线衍射法解析了分辨率达1.922 Å的嗜热内切纤维素酶Fpendo5A的晶体结构。Fpendo5A的整体结构呈现一个典型TIM桶状结构，具有糖基水解酶第五家族典型的(β/α)8拓扑结构，从整体上看，TIM滚筒结构的中心是平行的β片层结构，一周包裹着长短相间的α螺旋，这两部分构成了分子中比较稳定的结构基础。其中，分子的上端明显大于下端，呈现类似于沙拉碗（salad-bowl）的形状；与中温和低温结构同源物比较，Fpendo5A在氨基酸组成和分子内相互作用等方面具备高稳定性酶的结构特征；确定了Fpendo5A中与催化机制密切相关的四个氨基酸残基（His103、Glu144、His203和Glu260）；结合分子模拟，获得了Fpendo5A与四种达玛烷型四环三萜皂苷底物（人参皂苷 Rb1、 Rb2、 Rc、 和Rd）结合的模型，阐明了该酶水解达玛烷型四环三萜皂苷底物的催化机理及底物选择性机制，确定了Asn28、Trp38、His103、His104、Asn143、Glu144、Trp181、His203、Tyr205、Phe208、His212、Trp207、Glu260、Trp293和Phe299这15个残基为可能的催化和底物结合残基；利用定点突变的分子进化技术，获得了催化效率不同程度提高的四个突变体。通过本项目的实施，将开拓糖苷酶转化稀有人参皂苷在选择性机制方面的研究；推动稀有人参皂苷的工业化进程；尽早实现稀有人参皂苷等一系列有机生物活性分子在临床中的应用。