GL-V9诱导AML细胞分化为树突状细胞（DC）作用及机制研究

Anti-tumor immunotherapy which based on DC has very high application prospect. Either in clinical use, or laboratory research needs, new methods or inducers, which are faster and cheaper than the traditional induction method of cytokine combination, are urgently needed. Because of its advantages of source, quantity, leukemia specific antigens and others, AML-DC once drew attention of researchers. However, due to lack of function or disorder of AML-DC induced by traditional cytokine method, the AML-DC have yet to really realized its application. GL-V9 is a flavonoid new compound through structural modification of wogonin, an anti-tumor compound. We found it appeared effects of DC-like differentiation induction of AML cells in the study of its anti leukemia activity. It has not been reported that flavonoids induce DC differentiation.The purpose of this project is to confirm the DC differentiation induction effects of GL-V9, to evaluate its immune function, and to make a contrast between GL-V9 and cytokines. Through the results of phenotype and function, we try to optimize the induction scheme of GL-V9 on AML-DC to improve the application potential. This study extends anti-tumor application of the flavonoids, and provides a platform for the screening of natural products and derivatives to induce the differentiation of DC.

基于DC的抗肿瘤免疫治疗方法具有很高的应用前景，无论临床需求还是实验研究需要，都亟待出现比传统细胞因子联合诱导更为快捷和低廉的新方法或新诱导剂。AML-DC因为来源易获取、数量多、直接携带特异性抗原等优势，一度受到研究者关注。然而由于细胞因子方法所诱导的AML-DC往往功能缺失或失调，故迄今无法真正发挥应用价值。GL-V9是黄酮类抗肿瘤化合物汉黄芩素经结构修饰的新化合物，申请人所在课题组在研究其抗白血病活性时发现其作用下的AML细胞出现DC样分化，关于黄酮类化合物诱导DC分化作用迄今未见报道。本项目旨在通过确证GL-V9的AML-DC诱导作用，评价此种AML-DC的免疫功能活性，并与细胞因子等传统诱导方法作出对比。通过表型和功能的研究结果，尝试GL-V9诱导AML-DC的优化方案，提高其应用潜力。该研究拓展了黄酮类化合物的抗肿瘤应用范围，并为天然产物及衍生物诱导DC分化提供了筛选平台。

GL-V9是黄酮类抗肿瘤化合物汉黄芩素经结构修饰的新化合物，研究发现非致死剂量的GL-V9能够诱导AML细胞出现抗原呈递细胞（APC）表型，其中含有一定比例的CD83+ DC样细胞，经过GL-V9处理的AML细胞对CD3+淋巴细胞具有促增殖和激活功能。GL-V9在更高的剂量范围（≧2 μM）具有诱导AML细胞凋亡作用，且不同剂量范围药物诱导的AML细胞免疫表型变化和凋亡作用都可以被氯化铵或BAF逆转，显示药物对AML细胞的作用依赖溶酶体功能。分子机制研究表明，GL-V9能够上升AML细胞中总蛋白的泛素化水平，并同时干扰HSP90和客户蛋白的结合，引起包括AKT、FLT3、EGFR等在内的HSP90客户蛋白的溶酶体途径降解，从而诱导细胞产生APC表型或发生细胞凋亡等效应。在对淋巴系恶性血液瘤的研究中发现，非致死剂量的GL-V9不仅抑制T细胞恶性血液瘤细胞的生长和存活，而且还能诱导细胞出现形态学的变化（毛刺化和变大）、核改变（微核和多核）、G2/M期阻滞和多极中心体等有丝分裂灾变典型特征。此外，GL-V9能显著诱导恶性T细胞产生p53依赖性的细胞衰老现象。初步的分子机制研究表明，GL-V9促进p53乙酰化激活以及p21的表达，同时能显著抑制CHK1表达而不影响CHK2，抑制Cdc2的磷酸化激活，使细胞周期阻滞在G2/M期。此外，GL-V9能抑制细胞分裂过程中参与中心体及纺锤体形成的CENP-A、Mad2、BubR1和Plk1的表达，同时不影响Aurora A激酶的活性。体内研究表明，GL-V9能够明显抑制U937皮下移植瘤的生长，延长静脉接种AML原代细胞的NOD-SCID小鼠的生存期，表现出体内抗白血病效应。以上研究结果表明，GL-V9有潜力成为治疗AML的有效药物，且低剂量下诱导AML细胞出现APC表型对体内抗肿瘤免疫颇具意义，可能成为抗AML治疗的新思路。