条锈菌诱导的小麦候选感病基因TaHIPP1的感病机制解析

Wheat stripe rust is an important disease of wheat production. With the emergence and development of virulent races, most wheat cultivars have been lost disease resistance, which make wheat be in the threat of pandemic stripe rust. It is urgently needed to resolve the major issues to research the molecular mechanism of resistance to stripe rust in wheat cultivation of resistant varieties. Because stripe rust fungus couldn’t be cultured and lack of systematic study of the molecular status of wheat stripe rust resistance mechanism, the foundation of the project in the early work of the two candidates obtaining wheat stripe rust susceptible gene (TaHIPP) from the cDNA library of compatible interaction between wheat and CYR31. In addition, The full-length sequences of TaHIPP genes were cloned, and TaHIPP genes was verified to response to the stress on the metal ions by the yeast over expression. On these bases, the study researches the function of candidate disease gene TaHIPP1 by VIGS technology and CRISPR/Cas9 system, and searches its interactions downstream target proteins using the yeast two-hybrid system, which analysis the susceptible mechanism in the interaction between wheat and stripe rust, and then establish the foundation of creating lasting and broad-spectrum disease resistant varieties through susceptible gene silencing.

条锈病是我国小麦生产上的重要病害，随着强致病性小种的出现和发展，小麦生产上的多数主栽品种均已“丧失”抗病性，使得我国小麦再度处于条锈病大流行的威胁中，研究小麦抗条锈菌的分子机制进而培育抗性品种是目前急需解决的重大问题。针对条锈菌无法人工培养以及缺乏分子水平对小麦抗条锈病机理的系统研究的现状，本项目在前期构建的小麦与CYR31构建的亲和互作的cDNA文库中获得的2个候选的小麦条锈病感病基因（TaHIPP），通过电子克隆获得TaHIPP全长序列，而且利用酵母过表达验证了TaHIPP蛋白响应金属离子胁迫。在此基础上，拟通过VIGS技术和CRISPR/Cas9系统来验证候选感病基因TaHIPP1的功能，并利用酵母双杂交系统寻找与其互作的下游靶标蛋白，为解析小麦与条锈菌互作中的感病机制，进而为通过沉默感病基因创制持久、广谱抗病品种奠定基础。

由条形柄锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）引起的小麦条锈病是一种世界性范围内普遍流行的气传病害，严重威胁小麦生产。随着CYR31、CYR32和CYR33等强致病性小种的出现和发展，我国小麦生产上的多数主栽品种均已“丧失”抗病性，使得我国小麦再度处于条锈病大流行的威胁中，研究小麦抗条锈菌的分子机制进而培育抗性品种是目前急需解决的重大问题。然而，由于条锈菌无法人工培养的特性限制了小麦与条锈菌互作的分子机制的深入解析。随着2002年拟南芥中有助白粉菌生长的PMR6基因被克隆，De Almeida Engler 提议在育种过程中开发感病基因（susceptibility gene, S gene）作为一种可替代的抗病育种方式。申请者从所在实验室构建的条锈菌CYR31与小麦亲和互作的cDNA文库中分析获得差异表达序列，结合荧光定量PCR的实验结果筛选到TaHIPP1（Triticum aestivum HIPP protein）基因候选EST序列，研究发现在条锈菌侵染前期12h亲和组合中TaHIPP1的表达明显上调，而在非亲和互作中表达明显下调，表明TaHIPP1可能与植物的感病性相关，是候选的小麦感病基因。本项目通过突变异戊烯化蛋白的motif进行亚细胞定位分析，突变后只是定位在细胞核中，没有突变的蛋白定位于整个细胞。然后利用VIGS来验证候选感病基因TaHIPP1的功能，以及利用酵母双杂交系统寻找与其互作的靶标蛋白VDAC，以及摸索CRISPR/Cas9体系为解析小麦与条锈菌互作中的感病机制以及通过沉默感病基因为创制持久、广谱抗病品种奠定基础。