基于弹涂鱼多型卵黄蛋白原评价环境雌激素活性的研究

In the past decades, increasing attention has been given to evaluate adverse effects of endocrine disrupting chemicals (EDCs) in aquatic environments. Vitellogenin (Vtg) is a valuable biomarker for evaluating estrogenic EDC (EEDC) activities. Up to now, few studies focused on the estrogenic contamination in the tide flat of East China Sea. The mudskipper (Periophthalmus modestus) is an appropriate model fish for evaluating EEDC activities in tide flats due to its distribution and residence. The primary goal of the present study is to survey the impact of EEDCs contamination in tide flat by utilizing the Vtg of mudskipper as an estrogen-sensitive biomarker. Firstly, multiple vtgs will be cloned and characterized in this species. To develop and utilize immunoassays of Vtg proteins, characterization and identification on the subtypes of Vtg proteins will be performed. Recombinant Vtgs will be induced by a bacterial expression system, purified, and separately injected into rabbits to obtain some distinct antisera against mudskipper Vtgs, respectively. Subsequently, these antisera will be used to develop accurate immunoassays for the Vtg protein expression. The quantitative real time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) for the quantification of mudskipper vtg transcripts will also be newly developed using the specific primer set for each vtg subtype. Last but not the end, we will perform a practical field survey for detecting estrogenic activities in wild mudskipper collected from five distinct aquatic environments in China.

环境内分泌干扰物的存在直接威胁野生动物的生存和人类的健康, 对其作用机制及筛选方法的研究, 已经成为环境科学研究的热点领域。近年来, 鱼类卵黄蛋白原Vitellogenin（Vtg）作为水域环境内雌激素的“生物标志物”, 被广泛应用于环境毒理学研究。目前关于易受人类活动影响并蓄积环境雌激素的滩涂地区污染状况研究还很少。本申请拟以分布广泛、定居滩涂的弹涂鱼为模式种，结合分子克隆、蛋白重组、特异性抗体制备等手段，研究弹涂鱼多型Vtg构成；同时拟建立检测肝脏Vtg mRNA的Real-time PCR测定系和血清Vtg protein的ELISA、免疫层析检测系；通过雌激素投喂试验，揭示弹涂鱼多型Vtg表达量与雌激素活性的关系。此外，利用Vtg作为生物标志物，对生活在该水域的弹涂鱼所受环境雌激素干扰的生物效应进行评价，最终对我国东海沿海水域环境雌激素的污染现状和危害作出科学评价。

环境雌激素(estrogenic estrogens，EES)是指一类进入动物机体后,具有干扰其体内正常内分泌物质的合成、释放、运输、结合、代谢等过程，激活或抑制内分泌系统的功能,从而破坏维持机体稳定性和调控作用的化合物,其对人类和野生动物的有害效应已引起了国际的广泛关注。卵黄蛋白原(vitellogenin,Vtg)是雌鱼在卵黄形成时期血液中出现的雌特异性血清蛋白，但雄鱼和稚鱼在外源性雌激素作用下同样能诱导体内 Vtg 的生成。根据这一特性，Vtg可作为一种理想的雌激素或类雌激素效应的生物标志物,通过检测雄鱼和稚鱼体内Vtg的异常生成来指示水域中环境雌激素的污染状况。目前关于易受人类活动影响并蓄积环境雌激素的滩涂地区的污染状况研究还甚少。本研究将广泛分布、滩涂定居、喜食底质的弹涂鱼作为生殖内分泌研究的模式种，确立对环境雌激素的影响评价法及应用为目标。首先利用RT-PCR和RACE技术对弹涂鱼卵黄蛋白原基因进行了分子克隆，获得3型Vtg全长cDNA序列，并对其氨基酸序列进行同源性预测和分析，发现在系统进化上分别属于VtgAa、VtgAb和VtgC三种类型。然后根据已得到的三型Vtg cDNA序列，设计特异性引物建立相应的三型Vtg mRNA实时荧光定量PCR检测系。并且通过原核表达制备重组弹涂鱼VtgAa蛋白抗原，免疫新西兰大白兔获得弹涂鱼VtgAa蛋白特异性抗体。其次通过实验室内雌二醇(E2)和外源性乙炔雌二醇 (EE2)进行诱导处理，通过不同暴露浓度和不同暴露时间比较分析Vtg表达量的区别，筛选出对雌激素诱导有效且敏感的Vtg类型：VtgAa，作为生物标志物；最后开展了东海沿岸滩涂实地调查取样，通过检测弹涂鱼VtgAa表达水平分析结果发现，吕四和象山港存在一定的环境雌激素污染风险。本项目建立的弹涂鱼模式种的卵黄蛋白原生物标志物检测法，灵敏度佳，不需要从水环境中分离出单一污染物质等繁琐操作，就能对环境雌激素的综合活性进行评价，具有实际应用和推广价值。此外，本研究结果将为该区域水资源、水生生物及人类活动的调和安全可持续利用为最终目的环境保护及修复提供基础的科学资料。