靶向阻断BAM复合体蛋白相互作用的新型抗革兰氏阴性菌先导化合物的发现与药理学研究

Multidrug-resistant Gram-negative bacteria cause a range of intractable infection disease, which are estimated to cause approximately 700,000 deaths per year globally. With a prediction that this figure might reach 10 million by 2050. So it is urgent to develop new antibiotics to treat the infection of drug-resistant bacteria. The β-barrel assembly machine (BAM) inserts and folds integral membrane proteins into the outer-membrane of Gram-negative organisms, which is conserved and essential in bacteria. BAM complex consists of BamA and four lipoprotein subunits, in which BamD is most important. So we established a yeast two-hybrid system to identify small molecules that could block the interaction between BamA and BamD proteins form E.coli. Combining the screening of E.coli 25922 and the yeast two-hybrid system, we identified two compounds IMB-5372 and IMB-6060. Especially compound IMB-6060 showed strong antibacterial activity and low toxicity to eukaryotic cells. In this project, we plan to perform the following studies: (1) Continue the screening of the remaining compounds in order to obtain more leading compounds with better antibacterial activity. (2)Confirm the blocking effect of the small molecules using molecular biology experiments. (3) Study the interaction between the subunits of BAM complex using the yeast two-hybrid system and the active molecules. The work will help us to further understand the function of BAM complex and provide ideas on the development of new antibiotics against Gram-negative bacteria.

近年来由于抗生素的广泛使用，细菌耐药问题日趋严重，每年造成约70万人死亡，其中革兰氏阴性菌耐药问题尤为严重，因此开发新结构的抗阴性菌药物极为迫切。BAM复合体在细菌外膜蛋白的折叠装配中起到至关重要的作用，在阴性菌中较为保守，一直受到广泛关注。我们利用酵母双杂交技术构建了BAM复合体中关键蛋白BamA与BamD的相互作用验证模型。与大肠杆菌标准株联用对本实验室化合物库中的五万个化合物进行了初步筛选，得到了两个具有潜在靶向阻断作用的抗菌化合物IMB-5372与IMB-6060，其中IMB-6060显示出较好的抗大肠杆菌活性且细胞毒性较低。本项目拟继续联用靶向筛选与表型筛选对化合物库中剩余的十五万个化合物进行筛选。在分子和细胞水平考察活性化合物的靶向阻断作用及其分子机制。继而以靶向抗菌分子为探针，对BAM复合体中各配体蛋白之间的相互作用进行深入研究，为抗革兰氏阴性菌新药开发提供理论和实验依据。

革兰氏阴性菌耐药问题日趋严重，开发新结构的抗阴性菌药物极为迫切。BAM复合体关键蛋白BamA和BamD的缺失导致菌体的死亡，在阴性菌中较为保守，具备抗菌药物靶标筛选的可能性，本项目重点以BamA/BamD相互作用进行阻断剂的研究，探讨BAM复合体作为抗菌药物筛选靶标的可行性，发现新的先导化合物。项目执行期间，在酵母双杂交系统中检测到报告基因和BamA与BamD蛋白的表达，证明相互作用的存在；阳性化合物IMB-H4作用下模型菌中β-半乳糖苷酶活性剂量依赖性下降，在模型水平验证了相互作用的阻断；通过BLI和GST-pull down实验证实IMB-H4能与BamA结合来阻断BamA/BamD相互作用；酵母双杂交模型中和纯化的BamA蛋白均以非折叠状态存在，IMB-H4阻断的是非折叠状态的BamA与BamD的结合；IMB-H4能够诱导大肠杆菌长杆状形态的出现、表面纽扣状结构产生以及外膜缺损，IMB-H4作用下外膜蛋白OmpA和OmpC在外膜的含量降低，这些结果证实IMB-H4能够在菌体内阻断BamA/BamD的相互作用；IMB-H4对BamA蛋白过表达菌的MIC与空载体菌相比上调4倍，而BamD过表达菌并无变化，证实相互作用的阻断与其抗菌活性相关；IMB-H4能够降低多黏菌素、万古霉素和庆大霉素的MIC，具有明显的协同作用；IMB-H4对大肠杆菌标准株和临床耐药株均有不同程度的抑制活性，MIC为4-32μg/mL，对肺炎克雷伯菌和绿脓杆菌的MIC为4μg/mL，对鲍曼不动杆菌为32μg/mL，对Hela细胞的IC50为76.5μg/mL，毒性较低；IMB-H4类似物在酵母双杂交模型上并未表现出特异性抑制活性，表明IMB-H4对相互作用的阻断具有特异性；应用模型对化合物库中的10万个化合物进行了初筛，得到了10个在模型上具有靶向阻断蛋白相互作用活性的化合物，其中四个抗大肠杆菌MIC在100μg/mL以下的化合物能够明显降低多黏菌素的MIC，具有增敏作用；应用酵母双杂交技术评价了BamA与BamB、BamC、BamE蛋白之间的相互作用。项目的实施证实BamA/BamD相互作用作为抗革兰氏阴性菌药物研发靶标是可行的，构建的酵母双杂交模型能够应用于抗菌药物的筛选，建立了完整的机制评价方法，获得的阳性化合物为抗革兰氏阴性菌提供了先导化合物。