葡萄根癌病生防菌Agrobacterium vitis E26中双组分杂合组氨酸激酶AvhS的生防功能解析

Agrobacterium vitis E26是一株对葡萄根癌病有良好生物防治效果的生防菌株。通过Tn5转座子随机突变E26，生物学测定发现突变体M82生防能力显著降低。鸟枪法克隆后测序显示转座子插入破坏一双组分调控蛋白AvhS，该蛋白为杂合组氨酸激酶。研究拟通过构建AvhS缺失和互补突变体确认AvhS与生防功能的相关性；突变AvhS的两个信号接收域Rec1和Rec２，分析冗余结构与生防的关系；通过全基因组测序，结合生物信息学寻靶参与磷酸基团转移因子和与信号接收域互作的响应调节因子；构建互作载体，利用BACTH System 细菌双杂交系统确认筛选到的因子能够与AvhS互作；通过Microarray分析AvhS突变体和野生菌株中mRNA的表达量的差异，揭示AvhS调控基因的种类。最终明确AvhS是通过何种模式传递信号，利用何种途径调控E26菌株的下游基因，进而解析Avhs的作用机制。

通过Tn5转座突变，检测到一株生防能力显著降低的突变体，测序发现Tn5插入破坏了一双组分调控蛋白AvHS，该蛋白为杂合组氨酸激酶。检测了突变菌株的生长曲线、趋化性及其swarming、定植、产细菌素、引起过敏性反应、生物膜合成和产胞外多糖能力。结果发现，突变菌株在指数生长前期的信号浓度上升，后期又恢复正常。互补载体与菌株本身携带的质粒相容性很差，将基于IncP和IncQ的两类载体转入野生E26菌株后，菌株的重要性状随之消失。查阅近年来的文献表明，所有的同型Agrobacterium vitis生防菌株内至少存在2条染色体，而经典的生物2型生防菌株也K84携带较大质粒，致使二者的分子生物学研究无法深入。因此，项目组重新筛选了2株解淀粉芽孢杆菌LJ1和LJ02，对葡萄根癌病、葡萄白粉病和瓜类白粉病均有较好防效，并对LJ1、LJ02的生防机制进行了系统研究。.用LJ1和LJ02发酵液处理黄瓜幼苗后，发现四种酶活性、水杨酸含量以及病程相关蛋白基因表达量均明显升高，同时发现水杨酸信号可双向传导至根和叶，且该抗性属于由SA信号介导的系统获得抗性，另外诱导后根系的分泌物具有广谱抗性，可以抑制多种病原孢子的萌发和真菌的生长，并据此建立了一种快速定性检测诱导抗性的方法。在区分检测发酵液中无菌上清液和菌体重悬液在诱导SAR过程中的作用后发现，二者皆能引起水杨酸含量上升，其中菌体重悬诱导持续时间较长。.经测序显示LJ1和LJ02的基因组全长分别为4,192,735 bp和4,061,552 bp。经基因组分析，经核糖体途径合成硫醚抗生素（mersacidin, subitilosin A，ericin，sublancin），枯草菌素，环状细菌素，TOMM等抗菌物质；非核糖体途径可合成嗜铁素伊枯草菌素，芬荠素，表面活性素，二肽类溶杆菌素，杆菌烯，地非西丁，大环内酰亚胺，具有刹线虫蛋白基因AprE，合成2,3-丁二醇以及IAA的完整基因簇。经HPLC检测，LJ02可合成表面活性素，伊枯草菌素和吲哚乙酸。经LC-MS检测，抑菌蛋白包含1种抗菌肽、7种非典型蛋白、纤维素酶、逆境蛋白等35种肽类。经GS-MS检测，LJ02可合成34种挥发性有机物，并在解淀粉芽孢杆菌中新发现3种挥发性杀菌物质：4-乙基苯酚、2-乙基环己酮和反-2-壬烯醛。