GALNT3甲基化调控Mucin1糖基化修饰对喉癌转移的作用机制

Metastasis is an important factor affecting the prognosis of laryngeal carcinoma，but metastasis-associated genes and their mechanisms are still not very clear. Combined bioinformatic methods and validated experiments in clinical samples during the early stage, we found GALNT3 (galnac transferase 3) was significantly deregulated in laryngeal cancer samples. Gene Galnt3 was regulated by DNA methylation. It may regulate extracellular matrix proteins glycosylation like Mucin1 and involved in the regulation of tumor metastasis with low glycosylation in tumors. Our small sample study also found that the GALNT3 was associated with laryngeal cancer metastasis. So, we assume that the methylation of GALNT3 can result in insufficient Mucin1 glycosylation, promoting tumor metastasis of laryngeal carcinoma. For this aim, this proposed project aims to further detect GALNT3 expression level and the relationship with its methylation in large laryngeal cancer samples, evaluate its methylation sites; elucidate its relationship with prognosis using combined its clinical pathology features in GALNT3 methylation and Mucin1 glycosylation; and validate the effect of GALNT3 induced methylation and Mucin1 glycosylation on laryngeal cancer cells in vitro and in vivo. These results might provide new potential metastatic and prognostic biomarkers for laryngeal cancer treatment.

转移是影响喉癌预后的重要因素，但转移相关基因及其作用机制仍不甚清楚。我们前期利用生物信息学方法筛选结合临床样本验证，发现喉癌样本中GALNT3（GalNAc transferase 3）表达显著降低。GALNT3基因受DNA甲基化调控，并可能调控细胞外基质蛋白 Mucin1糖基化，而Mucin1糖基化水平可影响肿瘤的转移。我们小样本研究又发现GALNT3及Mucin1与喉癌转移相关。综上，我们假设GALNT3可能通过甲基化导致Mucin1的糖基化水平降低，促进喉癌等肿瘤的转移。为此，本课题拟进一步在大样本的喉癌组织中检测GALNT3基因表达及与甲基化水平的关系，并解析其甲基化位点；结合临床病理特征统计GALNT3甲基化和Mucin1糖基化水平与喉癌预后的关系；并在细胞和动物水平研究GALNT3甲基化介导的Mucin1糖基水平变化对喉癌细胞转移影响，为喉癌的转移和预后判断提供新的潜在标志物

标题︰.卷曲的螺旋域含有蛋白质 69 (CCDC69) 介导的肿瘤细胞凋亡. .背景与目的︰.肿瘤化疗耐药的分子机制了解甚少。为了寻找癌症化疗耐药基因，我们从癌症基因组图谱 (TCGA) 数据库提取了完整的135 癌症患者化疗反应信息。我们的分析显示 CCDC69 mRNA 表达水平在化疗敏感组与化疗耐药组之间有显著差异。此外， CCDC69 启动子甲基化与基因表达的呈显著负相关相关性。该研究的目的是研究 CCDC69 在的化疗耐药机制中的作用。 ..方法: 使用定量 RT-PCR 和免疫印迹法测定 A2780cis 和 SKOV3 细胞株中CCDC69的表达水平。采用亚硫酸氢盐测序办法测定CCDC69 启动子甲基化状态。由小干扰 RNA (siRNA) 和 CRISPR Cas9沉默A2780cis 和 SKOV3 细胞株中CCDC69基因的表达。顺铂治疗后细胞上的可行性进行 MTT 比色法和集落形成实验。细胞凋亡由膜联蛋白 V PI 染色和半胱氨酸蛋白酶 3/8 评估。流式细胞术测定细胞周期分布和线粒体膜电位 (ΔΨm)。免疫印迹法测定相关通路相。..结果︰在 A2780 和 A2780cis 细胞中CCDC69严重 CpG 甲基化 （73.1%和 74.3%）。在 A2780 和 A2780cis 细胞中，5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷可以使CCDC69 表达恢复。事实上，CCDC69 的表达水平是化疗敏感 A2780 细胞化疗耐药 A2780cis 细胞上的 3-4 倍。沉默CCDC69基因表达后使得耐药 A2780cis 细胞顺铂治疗敏感。使用CRISPR Cas9 基因敲除化疗耐药的 A2780cis 和 SKOV3 细胞 中CCDC69基因表达时， CCDC69KO A2780cis 和 CCDC69KO SKOV3 细胞增加对顺铂治疗敏感。此外，在顺铂作用下 CCDC69KO A2780cis 细胞，废除 G1 和 G2/M 周期，增加了半胱氨酸蛋白酶 3 及 8， ΔΨm 损失增加和 Bax 表达水平升高。当通过瞬时转染还原 CCDC69 CCDC69KO A2780cis 细胞中的表达，结果发现可以衰减对顺铂敏感性。通过免疫印迹发现中，敲除CCDC69后， p14ARF — Mdm2 — p53 细胞周期和细胞凋亡通路发生改变，在 CCDC69