乳酸乳球菌中耐酸相关sRNA及其结合蛋白相互作用的研究

Preliminary research results showed that expressing acid-tolerant genes could improve acid tolerance and the ability of nisin production. Using deep sequencing technology, we obtained 58 sRNAs of significantly higher expression under acid shock in Lactococcus lactis F44 with high nisin yield, but their function and mechanism are not clear. In this proposal, the method of RT-PCR will be used to verify the candidate sRNAs by detecting their expression levels under acid shock. The acid tolerance of strains will be examined when the selected sRNAs overexpressed or deleted in L.lactis F44. Meanwhile, transcriptome of L. lactis will be sequenced and analyzed to determine the acid tolerance sRNAs and their target genes. Our work may lay foundations for understanding of the network about the acid tolerance of Lactococcus lactis and improving nisin yield with the artificial acid tolerant regulatory network.

前期研究结果表明，表达耐酸基因可以提高乳酸乳球菌的耐酸能力及乳酸链球菌素(nisin)的生产能力。本课题组利用深度测序技术获得了高产nisin的乳酸链球菌F44在酸应激下显著差异上调表达的58个sRNA，但其功能及作用机制尚不清楚。本课题尝试应用RT-PCR技术检测候选sRNA在酸应激后的表达情况。然后进一步过表达或缺失候选sRNA，检测其对菌株耐酸能力的影响。进行转录组测序分析，初步确定乳酸乳球菌耐酸相关sRNA及其靶基因。本课题的工作为理解乳酸乳球菌的耐酸调控网络并以此为基础构建人工的耐酸调控网络来提高nisin生产能力奠定基础。

表达耐酸基因可以提高乳酸乳球菌的耐酸能力及乳酸链球菌素(nisin)的生产能力。课题以乳酸乳球菌F44在酸胁迫条件下获得的sRNA 深度测序结果为基础，对58个在酸应激下显著差异上调表达的sRNA进行qRT-PCR验证，筛选得到19个在酸胁迫下表达量明显上调的sRNA。根据筛选得到的候选sRNA基因，设计合成引物，通过PCR方法进行克隆，并通过构建穿梭表达载体，转化到乳酸乳球菌F44中进行过量表达，通过产酸能力和Nisin效价的变化分析过表达菌株对酸耐受性的影响，得到多个酸胁迫下表达量明显上调的sRNA，即s004，s013，s015，s042，s144，s263，c263。使用三种不同的靶标在线预测软件TargetRNA2、IntaRNA和Starpicker对以上sRNA进行靶标的筛选，并采用eGFP融合蛋白的方法进行了sRNA的靶标验证，分析讨论了sRNA与靶标mRNA之间的相互作用。本课题的工作为理解乳酸乳球菌的耐酸调控网络并以此为基础构建人工的耐酸调控网络来提高nisin生产能力奠定基础。