SIX1蛋白的翻译后修饰在肿瘤糖酵解中的功能及其机制研究

Warburg effect (aerobic glycolysis) has been considered to be one of the most important features of malignant tumor. The inhibitors of glycolysis for cancer treatment are being developed. Recently, we have reported that the oncogene SIX1 is a key transcription facter of tumor glycolysis and promotes tumor growth through Warburg effect. However, it is unclear whether the posttranslational modification of SIX1 protein regulates glycolysis and tumor growth. In our preliminary study, we found that there was phosphorylation modification in SIX1. We found the interfaction between SIX1 and ERK2 which can phosphorylate SIX1 in the site of Ser278. Therefore, we propose to study the effect and mechanism of SIX1 phosphorylation on tumor glycolysis and growth by using RNA interference, immunofluorescence, immunoprecipitation, and so on. Experiment such as glucose uptake detection, pyruvate detection, determination of lactic acid content, ATP level detection, growth curve analysis, animal experiment are to be performed to test the effect of phosphorylation of SIX1 on tumor glycolysis as well as regulation of the growth. Clinical significance of ERK2, SIX1, SIX1 phosphorylation and target genes of aerobic glycolysis are to be determined in the clinical samples of tumor patients, which contributes to elucidating the molecular mechanisms of cancer development and providing new clues and potential therapeutic targets.

Warburg效应（有氧糖酵解）已成为恶性肿瘤重要特征之一，针对糖酵解治疗肿瘤的抑制剂正在被开发。我们最近报道了癌基因SIX1是肿瘤糖酵解的一个重要转录因子，它通过调控糖酵解促进肿瘤生长，但SIX1蛋白的翻译后修饰是否调控糖酵解和肿瘤生长还不清楚。我们初步研究发现，SIX1存在磷酸化修饰，它与蛋白激酶ERK2存在相互作用，且ERK2能使SIX1 Ser278位点发生磷酸化。因此，我们拟在此基础上，利用RNA干扰、免疫荧光、免疫沉淀等技术深入研究SIX1磷酸化对肿瘤糖酵解和生长影响及其作用机制；利用葡萄糖摄取检测、丙酮酸测定、乳酸含量测定、ATP检测、生长曲线分析、动物实验检测SIX1蛋白磷酸化对肿瘤糖酵解的影响和肿瘤生长的调控；利用临床标本检测ERK2、SIX1、SIX1磷酸化及糖酵解下游靶基因在肿瘤患者中的表达，确定其临床意义，为阐明肿瘤发生发展的分子机制提供新的线索和潜在的治疗靶标。

恶性肿瘤细胞增殖活跃、代谢旺盛，与正常细胞能量代谢不同。肿瘤细胞自身可通过糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）转换适应代谢环境的改变。在正常细胞中，丙酮酸通过线粒体氧化磷酸化被氧化为CO2，在无氧条件下生成乳酸；在肿瘤细胞中，丙酮酸在有氧条件下代谢产生大量乳酸、消耗大量葡萄糖。肿瘤细胞中的这一现象被称为“Warburg”效应，是肿瘤标志性特征之一。.SIX1（Sine oculis homeobox 1）是同源盒基因家族中的成员，与胚胎细胞发育、器官分化有关，促进前体细胞增殖和生存。SIX1作为癌基因，可调节细胞周期进程，常高表达于恶性肿瘤中，可促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。但SIX1蛋白的翻译后修饰是否调控糖酵解和肿瘤生长还不清楚。.我们前期研究发现了SIX1是肿瘤糖酵解的一个重要转录因子，它通过调控糖酵解促进肿瘤生长。我们通过磷酸酯酶处理肿瘤细胞裂解物后，Western blot结果表明SIX1存在磷酸化修饰，NANOLC-MS/MS质谱筛选到SIX1磷酸化位点为S278。免疫共沉淀表明，它与蛋白激酶ERK2（Extracellular signal-regulated kinase 2）存在相互作用，且ERK2能使SIX1 Ser278位点发生磷酸化。荧光素酶报告基因活性分析、染色质免疫沉淀（ChIP）和Western blot实验表明，SIX1通过结合在糖酵解基因 GLUT1、HK2、PGK1、PKM2的启动子上，促进这些基因的转录和表达，然而SIX1（S278A）磷酸化突变体不能结合到这些糖酵解基因启动子上，也不能促进它们的转录和表达。糖酵解功能实验表明，野生型SIX1调控肿瘤细胞的葡萄糖摄取、丙酮酸生成、乳酸水平和 ATP 产生，但SIX1（S278A）突变体丧失这些功能。CCK8实验和裸鼠成瘤实验表明，野生型SIX1在体内体外均能促进肿瘤细胞的增殖，但SIX1（S278A）突变体失去功能。免疫组织化学实验表明，磷酸化（pSIX1）在肿瘤患者组织中的表达水平高于正常组织。综上所述，SIX1蛋白质的磷酸化修饰在调控SIX1的糖酵解功能和肿瘤生长中至关重要，为靶向糖代谢治疗肿瘤提供了新的候选靶标。