GSK3β/NF-κB信号轴对肺腺癌转移及EGFR-TKI耐药的作用机制

EGFR-TKI is a breaking history target therapy in lung adenocarcinoma, but patients occur recurrence and metastasis, also resistance to EGFR-TKI after 6-10 months. Many research tried to explore the mechanism of EGFR-TKI resistance, and it was very urgent to patients. In previous studies, we established the EGFR-TKI resistant cell lines, and performed microarray analysis. We found that GSK3β was overexpressed in resistant cells, and confirmed with western blot. Using siRNA to knock down GSK-3β can induce low expressions of downstream NF-κB related target genes. Based on previous study, we aimed to illuminate the mechanism of metastasis and resistance of EGFR-TKI in lung adenocarcinoma by co-active of GSK3β and NF-κB pathway,using Circulating tumor cells, resistant cells, tissue paraffin blocks and mouse. Finally, we tried to observe whether GSK-3β and NF-κB inhibitors can make EGFR-resistant lung cancer to regain drug-sensitivity.

肺腺癌靶向药物EGFR-TKI已取得了历史性突破，但治疗后会出现复发或转移，导致肿瘤细胞产生耐药性。不断探索靶向药物耐药机制，克服耐药的发生是迫切需要的。前期研究中成功建立EGFR-TKI耐药细胞株后，进行基因芯片分析，发现在EGFR-TKI耐药细胞中GSK-3β高表达，通过Westernblot证实活化的GSK-3β也高表达。通过siRNA敲除GSK-3β后发现下游靶基因NF-κB相关基因明显低表达，表明肺癌EGFR-TKI可能通过GSK-3β/NF-κB信号轴产生耐药，但其具体机制仍不清楚。基于前期研究结合循环肿瘤细胞、耐药细胞株、组织蜡块、动物实验的结果观察GSK-3β和NF-κB相关基因的分子生物学特性，阐明GSK-3β/NF-κB信号轴对肺腺癌转移和EGFR-TKI耐药的作用机制，进一步探讨EGFR-TKI耐药后可否利用GSK-3β和NF-κB抑制剂恢复药物敏感性。

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs），可有效用于治疗携带EGFR突变的非小细胞肺癌（NSCLC）。当前EGFR-TKIs的获得性抗性机制仍很大程度上未知。因此，本研究目的在于探究EGFR-TKIs获得性耐药相关机制。本研究通过低浓度递增法、CCK-8细胞毒性实验、平板克隆形成、Transwell小室实验、AnnexinV 和 PI双染细胞凋亡、RNA-seq测序、Real-time PCR、Western blot、免疫组化、慢病毒包装等实验方法，完成了细胞实验，并进行了组织蜡块实验和动物实验。利用GraphPad软件（数据以平均±标准差表示，P值<为0.05为差异有统计学意义）进行实验数据统计。本研究成功构建了肺癌吉非替尼耐药细胞株PC-9G，PC-9G细胞中无EGFR突变。PC-9G的增殖、迁移和侵袭能力均明显强于PC-9。PC-9或PC-9G细胞系中的RNA-seq检测及KEGG通路富集分析显示，差异基因在PI3K-AKT信号通路，该通路进行了基因热图聚类分析，GSK3β基因下调最明显。GSK3β的恢复下调了PC-9和PC-9G细胞的增殖、迁移和侵袭能力。AKT抑制剂（MK-2206）处理后，降低了PC-9和PC-9G中c-Myc的表达，结果表明，抑制AKT可以增加PC-9或PC-9G细胞的凋亡，减少转移。AKT激活剂（SC79）处理后，PC-9中c-Myc的表达显著升高，而PC-9G中的表达明显降低。结果表明，AKT的激活下调了PC-9细胞的凋亡率，并增强了PC-9G细胞的转移，然而这与GSK3β无密切关联。. 我们的研究结果首次证明了GSK3β的降低了PC-9G的细胞增殖、迁移和侵袭能力，提示GSK3β在PC-9肺腺癌细胞的吉非替尼耐药性中发挥了重要的抑制作用，提示GSK3β的功能并不依赖于AKT通路的上游。虽然GSK3β在NSCLC中不同EGFR突变类型之间的多样性效应的分子机制仍有待阐明，但当开发一种针对GSK3β的EGFR突变NSCLC的治疗策略时，还需要仔细评估GSK3β的特性。