褪黑素抑制Drp1介导的线粒体断裂在帕金森病中的作用及其机制研究

The primary pathology of Parkinson's Disease ( PD) ,is selective loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta，while the imbalance of mitochondrial dynamics (mitochondria fission and fusion)is a key pathological event of apoptosis in dopaminergic neuron．Our previous studies have shown that melatonin protects against rotenone-induced apoptosis in dopaminergic neuron, then we found that melatonin inhibit rotenone-induced mitochondrial dynamin-related protein 1 (Drp1) translocating from the cytosol to mitochondria. Antagonism or inhibition of Drp1 blocks mitochondrial fission as well as inhibit apoptosis. Thus ,we propose that melatonin protects substantia nigra dopaminergic neuron by down-regulating Drp1, which affects mitochondrial function and inhibit autophagy. In this study, we aim to use PD cell and animal modes, adenovirus-mediated small interfering technology, confocal and immunofluorescence to observe the efficacy of melatonin in cell and animal models of PD, which will confirm the view that melatonin protects dopaminergic neuron by down-regulating Drp1, balancing mitochondrial and inhibiting autophagy. Our study will further clarify the mechanisms of loss of dopaminergic neuron in the substantia nigra pars compacta and provide the useful therapeutic strategies for the treatment of PD.

黑质多巴胺神经元进行性凋亡是帕金森病(Parkinson's Disease, PD)发生的根本原因，而线粒体动力学改变（线粒体断裂与融合）是多巴胺神经元凋亡进行凋亡的关键因素。我们前期研究发现褪黑素可有效保护鱼藤酮引起的多巴胺能神经元凋亡，进一步研究发现褪黑素可抑制鱼藤酮引起的线粒体动态平衡关键蛋白Drp1的膜定位增多，而拮抗或干扰Drp1可有效抑制线粒体断裂并抑制自噬。因而，我们提出褪黑素治疗PD的新机制：褪黑素通过下调Drp1而稳定线粒体并抑制自噬，从而保护黑质多巴胺能神经元。本研究拟采用 PD细胞及动物模型，利用腺病毒小分子干扰、激光共聚焦、免疫荧光等手段，观察褪黑素对PD细胞及动物模型的治疗作用，证实褪黑素通过下调Drp1而稳定线粒体并抑制自噬而保护黑质多巴胺能神经元的观点，这将进一步阐明PD中黑质多巴胺能神经元凋亡的机制并为把褪黑素作为PD治疗候选新药提供理论支持。

黑质多巴胺神经元进行性凋亡是帕金森病(Parkinson's Disease, PD)发生的根本原因，而线粒体动力学改变是多巴胺神经元进行凋亡的关键因素。建立细胞模型后，测定线粒体膜电位，分析细胞色素C、 LC3II、Drp1 蛋白含量，通过免疫共沉淀及共聚焦显微镜，证实鱼藤酮诱导Drp1转位参与了帕金森病的发病机制。予雷帕霉素促进自噬， LC3II 定位在细胞线粒体，细胞线粒体结构受损，外周出现自噬双层膜，转染Drp1 siRNA 或给予Mdivi－ 1抑制Drp1 表达，Drp1、LC3II、Beclin－1、Bax 蛋白表达和细胞凋亡率下降，Mfn2、NRF1、P62、Bcl－2 蛋白表达增高，证实鱼藤酮处理后可诱导帕金森病模型细胞出现自噬、凋亡，抑制Drp1 表达后可缓解鱼藤酮所致自噬，保护神经细胞，提示Drp1 可能作为帕金森病治疗的潜在靶点。LRRK2基因模型数据与细胞模型类似。褪黑素可以抑制鱼藤酮诱导的SH-SY5Y 细胞死亡，线粒体受损及细胞色素C释放，提示褪黑素可以作为帕金森病治疗的潜在药物。进一步检测显示褪黑素预处理后，Drp1蛋白表达明显降低，线粒体中Drp1蛋白表达降低更为显著，Drp1自胞浆转移至线粒体也明显减少。过表达Drp1基因，可抑制褪黑素的保护作用，通过检测线粒体膜电位及细胞色素C、线粒体LC3II 蛋白表达，证实了褪黑素是通过调节Drp1表达来发挥保护作用。研究结果显示鱼藤酮可通过诱发自噬及线粒体功能异常导致细胞死亡，褪黑素通过抑制细胞色素C及下调Drp1表达，对自噬性细胞凋亡起保护作用，证实褪黑素通过下调Drp1而稳定线粒体并抑制自噬而保护黑质多巴胺能神经元的观点，这将进一步阐明PD中黑质多巴胺能神经元凋亡的机制并为把褪黑素作为PD治疗候选新药提供理论支持。课题发表SCI论文一篇，中文核心期刊一篇。