ROS/Ca2+/mPTP/cAMP/StAR通路介导氰戊菊酯抑制Leydig细胞睾酮合成的机制研究

Following elevation of the industrialization level of the society, the reproductive capacity of males has been gradually declining. Extensive use of pesticides is an important factor responsible for the impairment. Studies in recent years indicate male reproductive disorders caused by pesticides (including Fenvalerate ) are associated with excessive production of testicular reactive oxygen species (ROS), aggravated Leydig cell injuries and lowered plasma testosterone levels; however, the mechanism is not clearly known. This study is intended, firstly, to establish mouse models of reproductive toxicity at in vivo and in vitro (cellular) levels and explore the mechanism of excessive production of ROS in mitochondrial electron transport chains (ETC) of Leydig cells; secondly, to use molecular biology techniques, laser confocal microscopy and patch clamping to investigate the relationships among ROS, mitochondrial Ca2+ overloading, MAPKs phosphorylation and mitochondrial membrane permeability transition pore (mPTP) opening during the process of Fenvalerate -induced decrease of testosterone levels in Leydig cells and identify upstream influencing factors and downstream action targets; and also to establish the ETC/ROS/Ca2+/mPTP/cAMP/StAR pathway at the cellular level and perform validation in in vivo reproductive toxicity models so as to finally clarify the mechanism how fenvalerate inhibits Leydig cells from secreting testosterone. This study will provide new and effective action targets for preconditioned drugs in clinical treatment of male infertility.

随着社会工业化程度的提高，男性生育能力有逐渐下降的趋势，杀虫剂的广泛使用是导致男性生殖损伤的重要因素之一。近年研究发现，氰戊菊酯等杀虫剂引起的男性生殖障碍与睾丸ROS过量生成，加重Leydig细胞损伤以及降低血浆睾酮水平有关，但机制不明。本研究拟建立小鼠在体、离体（细胞）水平的生殖毒性模型，首先探明氰戊菊酯引起ROS在Leydig细胞线粒体电子传递链（ETC）中过量生成的机制；其次应用分子生物学、膜片钳等技术，研究氰戊菊酯在抑制Leydig细胞睾酮合成的过程中，ROS、线粒体Ca2+超载、MAPKs磷酸化和线粒体膜通透性转换孔（mPTP）开放之间的作用关系，明确上游影响因素和下游作用靶点，拟在细胞水平确立ETC/ROS/Ca2+/mPTP/cAMP/StAR的信号通路，并通过在体生殖毒性模型加以验证，最终阐明氰戊菊酯抑制Leydig细胞睾酮分泌的分子机制，为临床治疗男性不育提供理论支持。

随着社会工业化程度的提高，男性生育能力有逐渐下降的趋势，杀虫剂的广泛使用是导致男性生殖损伤的重要因素之一。近年研究发现，氰戊菊酯等杀虫剂引起的男性生殖障碍与睾丸ROS过量生成，加重Leydig细胞损伤以及降低血浆睾酮水平有关，但机制不明。. 我们的实验结果表明，氰戊菊酯(Fen)抑制了线粒体主呼吸链复合体(Complex)I和ComplexIII的活性，导致呼吸链电子传递功能受损，电子漏增加，从而引起Leydig细胞活性氧(ROS)激增；激增的ROS引起Leydig细胞胞外Ca2+内流增加，内流Ca2+又进一步加剧Leydig细胞氧化应激，细胞随之发生线粒体损伤，线粒体膜电位下降，导致氧化呼吸链ATP合成障碍，胞内cAMP水平随之下降，cAMP/PKA依赖性的睾酮合成相关的STAR、HSD3B和CYP11A1等蛋白和酶表达减少；同时，线粒体损伤激活了Leydig细胞线粒体凋亡途径，这些机制共同作用，最终引发Leydig细胞的睾酮合成障碍。. 在项目的实施过程中，经课题组成员讨论分析，我们猜测Fen除了可干扰雄性大鼠睾酮分泌之外，也可能会对其他重要的生殖激素具有内分泌干扰作用，因此，我们同时分析了大鼠体内多种重要的生殖激素水平，如GnRH、FSH、LH以及E2等，同时检测了相关激素的受体、结合蛋白的表达水平。实验结果验证了我们的猜测，即大鼠体内多种生殖激素水平以及其受体和结合蛋白的表达均发生了显著的变化。各种激素分别通过不同的机制作用于精子发生，同时又相互影响，共同导致雄性生殖损伤；同时，我们还发现，Fen引起的氧化应激可以广泛作用于多种睾丸组织细胞（如Leydig细胞以及各级生精细胞），激活其线粒体凋亡途径，致使Leydig细胞数量减少以及曲细精管结构损伤，大鼠精子质量随之下降。因此，我们认为，Fen可能同时通过直接途径（促凋亡作用）和间接途径（内分泌干扰作用）共同作用于雄性大鼠的精子发生过程，导致雄性大鼠生殖损伤。.