采用模式动物及转基因技术研究人zp1突变致卵透明带缺失的机制

Human zona pellucida is composed of four glycoproteins (ZP1-4), which plays an important role in the reproductive process.Here we describe a form of infertility with an autosomal recessive mode of inheritance,characterized by abnormal eggs that lack a zona pellucida. We identified a homozygous frameshift mutation in zp1(GenBank accession number KJ489454).We propose that"the mutant ZP1 promotes interaction with other zona proteins.The intracellular sequestration of zona proteins could impede their trafficking to the extracellular milieu,thus precluding the formation,resulting infertility".Our project aims to: 1.researching the interactions between mutant ZP1 and ZP2~4 with the transgenic in vitro experiments by lentiviral transfection and nuclear microinjection method,to clarify the mechanism of mutant ZP1 impede other zona proteins trafficking to the extracellular milieu by COIP and BIFC technology;2.building the CRISPR/Cas9 mice carrying the same mutant zp1 by gene knockout technology,to verify this pathogenic mutant. Making a foundation for carrying out the treatment of zona pellucida lacking or abnormal .

人卵透明带由四种糖蛋白组成（ZP1-4），在生殖过程发挥重要作用。前期我们首次发现由于卵子透明带缺失导致家族性不孕的新疾病，筛查出符合常染色体隐性遗传模式的新致病基因zp1（GenBank accession number KJ489454)，提出"变异ZP1在卵子内发生负性作用以低聚其他透明带蛋白，阻止蛋白向细胞外转运导致透明带缺失，致使患者不孕"的致病机制假说(N Engl J Med 2014;370(13):1220-6)。本课题拟：以新致病基因zp1为研究对象，采用慢病毒转染及核显微注射方法，行转基因体外细胞实验，以COIP和BIFC技术，研究突变ZP1和正常的ZP2～4之间的相互作用，阐明变异ZP1本身及其阻止ZP2-4向细胞外转运的机制；采用CRISPR/Cas9基因敲除技术构建携带相同zp1突变的疾病模式小鼠，验证突变的致病性，为开展透明带缺失/异常的临床治疗研究奠定基础。

人卵透明带由四种糖蛋白组成（ZP1-4），在生殖过程发挥重要作用。前期我们首次发现卵子透明带缺失致不孕的病因，筛查出符合常染色体隐性遗传模式的新致病基因zp1（GenBank accession number KJ489454)，提出“变异ZP1在卵子内影响其他透明带蛋白向细胞外转运导致透明带缺失”的致病机制假说(N Engl J Med 2014;370(13):1220-6)。本项目在前期基础上设定三个主要项目目标开展相关系列研究：1.构建两组细胞模型研究人/小鼠突变ZP1与正常ZP2、ZP3、ZP4（ZP4仅限人）之间的相互作用，采用获得突变后ZP1蛋白发生截短、不能与ZP3、ZP4发生相互作用等功能变化的实验结果（实现目标1）。2. 采用CRISPR/Cas9基因敲除技术分别构建携带zp1突变小鼠/大鼠动物模型（由于小鼠模式动物的表型与人类表型存在显著差异，在项目设计基础上增加构建了大鼠疾病模型），分别对构建的大/小鼠动物模型进行Zp1-7+/-和Zp1-7-/-进行出生后发育和自然生育力、卵子透明带表型（普通光镜、电子显微镜的形态学）、体外受精及胚胎发育潜能等研究，证实小鼠与人表型差异不宜作为人ZP异常的动物模型，首次成功构建大鼠ZP1突变模型，应用Zp1-7-/-大鼠模型阐释卵母细胞缺失透明带并导致卵丘复合体结构紊乱、卵母细胞凋亡而导致不孕的致病机制。3. 对ZP1突变小鼠与大鼠模型各三个基因型（野生、杂合、纯合子）进行ZPs（包括突变ZP1和正常ZP1、ZP2-4）在卵巢各发育阶段卵细胞中的表达定位和共定位研究，结合细胞模型结果，阐明人突变ZP1通过阻止ZP3和ZP4向细胞外转运而导致人卵透明带形成障碍及不孕的致病机制（目标3）。总之，本项目已全部按期完成项目立项所计划的研究内容，在增加了构建大鼠基因编辑模型和细胞模型的基础上，达到预期目标，研究结果在人ZP异常致病机制、ZPs功能的种属差异有创新性发现；为未来开展人ZPs功能动物模型研究打下坚实的实验基础。