超声纳米泡介导Agrin基因转染对功能性肌肉移植后运动终板结构影响的实验研究

Free functional muscle transplantation is clinically effective means of movement function restitution in extremities. However, the decline of muscle force after transplantation, directly affects the reuslts of the motor function reconstruction. Study found that neurogenic Agrin in endplate of skeletal muscle plays an important role in the formation of the mature and maintaining and regeneration, which is the key factor in the muscle force recovery after transplantation. Ultrasound micro-bubble technology with its safety, high efficiency, target of controllable etc, has wide prospect of clinical application in gene therapy. In this study, free gracilis transplantation models are used in Zealand white rabbit. The evolution of endplate and acetylcholine receptors after ultrasound nanoscale lipid bubble mediated exogenous Agrin gene transfection is observed, in order to explore the new method of improving muscle function recovery after transplantation, improving the treatment effect of the free transfer. The development of this project for providing new treatments in improving muscle function recovery after transplantation and for understanding muscle movement endplate reconstruction mechanism after transplantation, has important significance.

功能性肌肉游离移植是临床上治疗肢体运动功能障碍的有效手段。然而，肌肉移植术后肌力下降直接影响肢体运动功能的重建效果。研究表明移植后骨胳肌肌力的改变与终板区神经源性聚集蛋白(Agrin)的表达密切相关。超声纳米微泡作为一种新型的基因载体具有安全、高效等优势。本课题采用新西兰大白兔自体股薄肌游移植模型，从调控肌肉移植后运动终板和乙酰胆碱能受体的演变入手，采用薄膜水化- - 声振法制备负载Agrin基因的纳米微泡，以超声辐照纳米微泡介导基因转染为治疗手段，从基因水平探索改善游离肌肉移植后功能恢复的新方法，旨在提高功能性肌肉游离移植的治疗效果。本课题的开展将对改善移植后肌肉功能的恢复提供新的治疗手段，对提高功能性肌肉移植的功效、改善肢体运动功能的重建效果具有重要意义。

功能性肌肉移植后肌力的改变与终板区神经源性聚集蛋白(Agrin)的表达密切相关。本项目拟制备负载Agrin基因的纳米微泡，以超声辐照纳米微泡介导基因转染为治疗手段，从基因水平探索改善游离肌肉移植后功能恢复的新方法，旨在提高功能性肌肉游离移植的治疗效果。主要研究结果：(1) 成功构建获取了神经源性Agrin-G3基因片段，并测序证实所获得的靶基因片段碱基序列与基因库（GenBank）基因序列一致，完成质粒构建，解决了外源性靶基因的获取问题。为后续完成负载靶基因微泡的制备和靶基因治疗方案的实施奠定了基础。(2) 制备负载Agrin-G3基因片段的纳米级微泡，完成理化特性和体外功能性检测。从Agrin-G3-NBs结构特性及微泡稳定性和超声敏感性进行检测评估，符合本项目研究需要。进一步通过体外细胞研究评估Agrin-G3-NBs联合超声辐照的体外转染效能，应用流式细胞仪检测、荧光显微镜观察等方法着重评估Agrin-G3-NBs联合超声辐照介导Agrin-G3基因转染的效率，证实该技术能够有效介导靶基因的转染；又从基因水平和蛋白水平检测Agrin-G3基因转染后表达情况，结果表明转染后Agrin-G3基因能够有效表达。上述研究证明了负载Agrin-G3纳米微泡联合超声辐照介导Agrin-G3基因转染是可行的，为后续Agrin-G3基因在体功能性研究奠定了基础。(3) 应用股薄肌模型，初步观察负载Agrin-G3基因的纳米级超声微泡联合超声辐照介导靶基因转染对股薄肌运动终板的影响。通过对失神经支配4周股薄肌运动终板的免疫荧光染色检测，初步证实Agrin-G3基因转染后能够延缓失神经支配股薄肌运动终板的退变过程；一定程度上说明应用外源性Agrin-G3基因干预骨骼肌运动终板的退变是可行的，但全面系统的评估Agrin-G3基因转染后的作用效果有待后续研究来完成。