过氧化物氧还蛋白Prx II过氧化氢酶新功能发现及其机制研究

Peroxiredoxin II（Prx II）蛋白是胞内重要的抗氧化蛋白，以往研究认为， Prx II蛋白通过其过氧化物酶（peroxidase）活性来还原过氧化氢，其最终还原力为NADPH。本项目拟在前期研究中发现Prx II蛋白具有直接分解过氧化氢能力的基础上，拟利用高灵敏性的过氧化氢测定系统，建立Prx II蛋白的还原态-氧化态转变体系，验证不同氧化还原状态下的Prx II蛋白是否具有过氧化氢酶这一新功能，并测定其酶动力学参数，最后利用蛋白三维结构信息，通过比较Prx II蛋白和过氧化氢酶在活性位点、构效关系及催化机制上的异同，阐明Prx II蛋白作为过氧化氢酶的新机制。

过氧化物氧还蛋白Peroxiredoxin (Prx)被认为是胞内除CAT，GPX之外，又一类新的具有还原过氧化氢能力的抗氧化蛋白家族，在脊椎动物中，该家族含有六个成员(Prx I-Prx VI)，这些蛋白能有效结合并消除胞内的过氧化氢，在维持胞内ROS内稳态的过程中发挥重要的作用。近十余年来，Prx蛋白的催化、“失活”及“复活”机制倍受人们关注。以往的研究认为Prx蛋白通过其过氧化物酶(peroxidase)活性来还原过氧化氢，其最终还原力为NADPH。本课题前期研究中发现黑青斑河豚Prx家族的成员(Prx I/Prx II)具有直接分解过氧化氢能力，本研究旨在确认Prx I/II是否具有过氧化氢酶样(CAT样)功能，同时探讨其活性位点、构效关系及催化机制，并尝试揭示其生理学意义。(1)研究首先优化Prx I/Prx II可溶性蛋白的纯化体系，建立Prx I/Prx II蛋白的还原态-氧化态转变体系，利用高灵敏性的过氧化氢测定系统，明确了氧化型和还原型的Prx I蛋白均具有CAT样功能。(2)研究测定了Prx I蛋白的酶动力学参数，酶动力学曲线表明该酶活具有正协同效应和底物抑制作用，同时探讨了其最适温度、温度稳定性、最适pH和pH稳定性情况。(3)研究着重围绕Prx I蛋白CAT样功能的活性位点、构效关系及催化机制开展研究，研究结果显示该CAT样功能与Cys残基无关，表明其催化机制和传统的peroxidase活性完全不同；利用生物信息学及Prx I/Prx II蛋白三维结构信息，预测并证明了二聚体形成界面上的“GLY117VAL118LEU119” 是其活性中心，该口袋状结构被破坏后，Prx I蛋白的CAT样活性消失；过氧化氢酶的特异性抑制剂不能抑制Prx I蛋白的CAT样活性，Fe是该酶活的辅因子。上述生化特征均表明Prx I蛋白的CAT样活性系一新功能，其活性中心、催化机制与其他抗过氧化氢蛋白完全不同。(4)生理学功能显示，在过氧化氢较高浓度下，Prx I蛋白的CAT样活性而非Prx活性调控了胞内ROS水平，进而调控胞内过氧化氢信号通路的激活。总之，Prx I蛋白CAT样新功能的酶动力学参数，活性中心及其催化机制与Prx活性、CAT完全不同，系一全新的抗氧化功能，该蛋白在调控胞内ROS积累及过氧化氢信号通路的激活过程中发挥重要作用。