花苜蓿（Medicago ruthenica）越冬芽适应青藏高原寒冷胁迫的分子机制

Lacking of adaptable cultivated legumes is the key problem affecting healthy development of grassland & animal husbandry in the Qinghai-Tibet Plateau(QTP). Medicago ruthenica, widely distributed in the eastern margin of the QTP, is the only species in Medicago genus that can adapt to alpine area. Previous studies found that this plant can form many underground overwintering buds (OWBs) in 8-9 momths.Those buds can survive at -45℃ in extremely cold winter. But the mechanism of OWBs cold resistance is still unclear. Therefore, the project selected wild M. ruthenica growing in the original habitat of QTP to research the following contents: 1) to reveal the growth rhythm of M. ruthenica in winter by tracking observation developmental and physiological changes of OWBs, 2) RNA-seq is used in this research to identify differentially expressed genes of OWBs responsive to cold hardiness at different developmental stages.3) Finally, the separated genes associated to cold hardiness are transferred to Arabidopsis to identify their function.The research will make the relationship between growth rhythm and cold hardiness of OWBs clear, clarify the molecular mechanism of cold hardiness of M. ruthenica , and isolate the functional genes, which can provide the base for breeding of new cold hardiness alfalfa varieties adaptable to cultivate in the QTP.

缺乏适应于高寒牧区种植的豆科牧草是影响青藏高原草牧业健康发展的重要因素。花苜蓿（Medicago ruthenica）在青藏高原东缘广泛分布，是高寒地区唯一能越冬生长并完成生活史的豆科苜蓿属植物。前期研究发现，该植物在8-9月会形成许多地下越冬芽，这些芽能在-45℃安全越冬，具有极强的抗寒性，但其抗寒机理尚不明晰。本项目选取花苜蓿为试材，在青藏高原原生境下开展以下研究：1）跟踪观测地下芽在自然越冬过程中形态发育与生理特性变化，探明花苜蓿在高寒草地漫长冬季的生长节律；2）以此为基础确定取样关键时期，采用RNA-seq高通量测序技术对越冬芽进行转录组测序，通过差异基因表达分析，筛选出抗寒相关基因；3）利用拟南芥进行关键基因转化和功能验证。本研究旨在阐明越冬芽生长节律与抗寒性之间的关系，揭示花苜蓿适应高寒环境的分子机制，挖掘优异的功能基因资源，为苜蓿高原抗寒育种和栽培技术研究提供基础依据。

本项目研究对象是广泛分布在青藏高原东北部高山草原的苜蓿属野生牧草，该植物越冬前能产生大量地下芽，抗寒性极强，探究该植物越冬抗寒机制，对苜蓿属牧草抗寒育种和高原栽培技术研究具有重要参考价值。本研究在青藏高原原生境下开展试验，拟通过跟踪观测越冬芽在自然越冬过程中的生长变化，探明芽在高寒牧区冬季的生长发育节律，确定取样时期，采用转录组测序技术筛选抗寒相关基因，揭示该植物适应高寒环境的分子机制。主要结果如下：1）基于微形态分析、地理分布与分子鉴别方法，重新鉴定后发现本项目研究对象为矩镰荚苜蓿（Medicago archiducis-nicolai），是花苜蓿（M. ruthenica）的近缘种；2）矩镰荚苜蓿种群在生长季主要行营养生长，营养繁殖是该植物的主要繁殖方式；3）20cm根茎切段长度×10cm种植深度×0cm覆草组合处理是原生境条件下该植物根茎繁殖的最佳栽培条件；室内条件下，昼夜温度25℃/15℃（14h/10h）、土壤含水量18-20％时，株高和成苗率最高；4）越冬期间矩镰荚苜蓿通过地下芽休眠状态的节律性变化抵御青藏高原寒冷胁迫，经过淀粉粒水解代谢，增加细胞可溶性糖浓度、降低细胞冰点是其抵御冬季低温胁迫的适应机制；5）通过转录组数据分析，共筛选出17682个DEGs和729个转录因子；对DEGs进行功能富集分析，发现DEGs主要集中在氧化还原过程、碳水化合物代谢过程、脂质代谢过程等6大类中；在上述通路中筛选出TPS、SUS（E2.4.1.13）、PME（E3.2.1.2）、GPAT、AGPAT、DGAT、PAL、POD（E1.11.1.7）、CHS、MYBP等10个DEGs，测定其在地下芽越冬全期的表达量，发现以上基因在两年的数据中均表现出稳定的规律性变化，表明这些基因在地下芽越冬过程中发挥着重要作用。.本研究解决了试验对象的物种分类问题，明晰了矩镰荚苜蓿的无性繁殖特性，探明了地下芽在冬季的生长发育节律，通过转录组数据分析，筛选出了抗寒相关差异基因，从形态、组织、细胞和分子水平揭示了矩镰荚苜蓿对青藏高原寒冷胁迫的适应机制，为后续筛选优异的功能基因资源、培育苜蓿属抗寒新品种奠定了理论基础。