无籽沙糖桔自交不亲和相关基因的克隆及表达特性分析

柑桔的无籽性是一个优良的经济性状，对鲜食和加工均具有重要意义，是各国育种家培育柑桔新品种的重要目标之一。本研究以无籽沙糖桔(配子体自交不亲和性)和有籽沙糖桔(自交亲和性)为试材，在已探明无籽沙糖桔无籽原因在于配子体自交不亲和，并进行了这两个材料S-RNase同源基因克隆的前期研究基础上，采用抑制性消减杂交(SSH)技术构建无籽沙糖桔自交后72 h花柱、成熟柱头和成熟花粉SSH cDNA文库，利用菌液PCR结合反向Northern对文库进行筛选，然后对差异克隆测序并进行生物信息学分析，找到与无籽沙糖桔自交不亲和相关的克隆，并运用Real-Time PCR技术鉴定这些克隆的表达特性，了解参与无籽沙糖桔自交不亲和过程相关基因的种类和表达情况，为最终分离无籽沙糖桔自交不亲和基因奠定基础。研究结果不仅可以加深对柑桔无籽形成机理的认识，而且对沙糖桔及其它柑桔的品种改良也有重要的理论和实践意义。

自交不亲和是导致柑桔无籽的重要原因之一。然而，到目前为止，柑桔SI分子机理还不清楚。本论文以无籽沙糖桔（SI）和沙糖桔（Self-compatibility, SC）为材料，利用SSH技术开展了无籽沙糖桔自交不亲和相关基因的分离与鉴定和表达特性分析，获得了以下结果：（1）克隆了无籽沙糖桔和沙糖桔S-RNase基因。列比较分析发现，两者cDNA开放阅读框完全相同，而无籽沙糖桔的5′非编码区、3′非编码区和基因组DNA序列分别发生了连续13、9和6个碱基的缺失。表达特性进行分析结果表明，S-RNase基因在无籽沙糖桔花柱中表达量明显高于其它部位，是叶片的10倍，花药的5倍；而沙糖桔不同组织表达差异不明显。无籽沙糖桔自交授粉后3 d S-RNase表达量最高，而无籽沙糖桔与沙糖桔异交授粉后3 d S-RNase几乎不表达。Southern杂交结果表明，S-RNase基因在无籽沙糖桔和沙糖桔基因组中均以2个拷贝数形式存在。（2）构建了雌蕊抑制性消减杂交SSH文库，获得了CaBP、C2区域蛋白、锌指蛋白、S1-3.15、UBE1等可能与SI相关的基因。表达特性进行分析结果表明，CaBP在无籽沙糖桔花柱和自交后3 d雌蕊中明显上调表达，而S1-3.15和UBE1在沙糖桔子房和花药中的表达量约为无籽沙糖桔的60倍和7倍。（3）构建了花粉SSH文库，或得了F-box基因、S1、UBE2、UBE3、RNaseHII等一些可能与SI相关的基因。qPCR分析结果表明，F-box、S1和RNaseHII在无籽沙糖桔花粉中的表达量分别为沙糖桔的5倍、5倍和3倍。F-box、UBE2、S1、UBE3和RNaseHII在无籽沙糖桔自交授粉后3 d雌蕊中的表达量分别为无籽沙糖桔和沙糖桔异交授粉后3 d雌蕊的3倍、2倍、10倍、5倍和5倍。（4）构建了自交后72 h花柱SSH文库，获得了Skp1-like、Autoinhibited Ca2+-ATPase 1、U-box、Serine/threonine kinase等可能与SI相关的基因。qPCR分析结果表明，Skp1-like和U-box在无籽沙糖桔子房中明显上调表达，分别是沙糖桔子房表达量的20倍和2倍；无籽沙糖桔自交授粉后，Skp1-like基因和U-box在无籽沙糖桔自交后4 d雌蕊中明显上调表达，约为沙糖桔异交后4 d雌蕊表达量的20倍