成骨细胞分化的关键调节因子Osterix的翻译后调控机制的研究

Osterix是近年发现的成骨细胞分化和骨形成过程中的关键转录因子，目前该基因的表达调控机制不是很清楚，特别是翻译后调控机制的研究更为薄弱。我们最近的研究发现，外源性和内源性的Osterix在Western blot中均呈现2条带，且用蛋白酶体抑制剂和磷酸酶抑制剂处理细胞可以分别导致Osterix的稳定性和磷酸化水平的增加。同时，生物信息学分析也提示Osterix存在磷酸化、乙酰化和泛素化修饰位点。由此，我们推测Osterix存在磷酸化、乙酰化和泛素化修饰且翻译后修饰对Osterix的蛋白质稳定性及活性起重要调节作用。本项目拟通过抑制剂处理、免疫共沉淀和报告基因分析等技术对该假说进行验证。本项目的研究结果不仅有助于阐明Osterix的表达调控机制，而且有助于阐明骨代谢过程，特别是为骨质疏松及其他骨病的分子机制的阐明提供帮助，从而为临床药物的设计以及骨相关疾病的基因治疗提供依据。

我们严格执行原研究计划，不仅完成了项目计划书中制定的研究内容，而且增加了课题研究的广度和深度，为该项目的后续研究奠定了坚实的理论和实验基础。主要研究结果如下：. 我们发现，环己酰亚胺（CHX）处理后，Osx的蛋白稳定性明显降低。当用蛋白酶体抑制剂MG-132和lactacystin处理时，Osx的蛋白稳定性则显著增加。Co-IP的结果表明，Osx存在泛素化修饰。通过Lys点突变质粒的构建以及荧光素酶报告基因实验，我们初步筛选出Osx的6个Lys位点为潜在的泛素化修饰位点。通过Co-IP实验和蛋白稳定性检测，我们确定 K58和K230是Osx的泛素化修饰位点。在C2C12细胞中，Osx(K58R)和Osx(K230R)显著上调成骨细胞分化的marker基因包括碱性磷酸酶、I型胶原和骨钙素的mRNA表达并促进C2C12细胞向成骨细胞方向分化。. 我们同时还发现，磷酸酶抑制剂PhosStop处理明显增加Osx蛋白水平。生物信息学分析提示，Y12、S31、Y48、S76、S80、S96、Y229、S386、T397、T405、T414、S422是Osx潜在的磷酸化位点。通过荧光素酶报告基因实验，我们发现，和野生型Osx表达质粒相比，Y48F、Y229F、T405A、T414R、S422R能显著降低荧光素酶报告基因的活性。通过液相色谱-质谱/质谱联用（LC-MS/MS）技术，鉴定出S422为Osx的磷酸化修饰位点。PhosStop处理不能增加Osx(S422R)磷酸化水平。此外，我们还发现GSK-3β和Osx存在相互作用并增加Osx的磷酸化水平及其反式激活活性。. 最后我们还发现，去乙酰化酶抑制剂TSA或HASA处理均能增加Osx的蛋白水平。过表达HDAC4导致Osx蛋白水平降低，而过表达p300则导致Osx蛋白水平增加。我们用IP实验证明，Osx存在乙酰化修饰。Co-IP的结果表明，Osx和HDAC4以及p300分别存在相互作用。细胞免疫荧光分析表明，p300和Osx共定位于细胞核，而HDAC4则引起Osx出核。K46被初步鉴定为Osx的乙酰化位点，因为1）Osx(K46R)的乙酰化水平明显下降；2）HDAC4不能引起Osx(K46R)出核；3）荧光素酶报告基因实验的结果表明，和Osx(WT)相比，Osx(K46R)对TSA处理没有明显反应。