进化工程与动态调控大肠杆菌从头合成紫檀芪的研究

Pterostilbene, a methoxylated structural analog of resveratrol, has higher stability and bioactivity than that of the parent compound. Pterostilbene has been widely used as nutraceutical and refined chemical with wide range of applications. Production of pterostilbene by recombinant E. coli fermentation presents green and sustainable manners compared to plant extraction and chemical synthesis. However, biosynthetic inefficiency, and metabolic imbalance between precursor malonyl-CoA and p-coumaroyl-CoA limit high-efficiency pterostilbene production. In this project, we plan to solve the abovementioned problems. Firstly, to establish an efficient and novel heterologous pathway using directed evolution, TIGR regulation and chromosome evolution. Secondly, we applied malonyl-CoA and/or L-tyrosine biosensor for dynamic modulation of malonyl-CoA and p-coumaroyl-CoA pathway flux. We believe that the idea and result developed in this project will be a reference for other nutraceutical biosynthesis pathway regulation in microbial cell factory.

紫檀芪是白藜芦醇的甲基化衍生物，化学结构具有更强的稳定性和生物活性，其作为营养化学品和精细化工品具有广泛的应用价值。重组大肠杆菌发酵法是替代植物提取法和化学合成法实现绿色、可持续生产紫檀芪的重要方法。然而，外源合成途径效率低以及丙二酰辅酶A和对香豆酰辅酶A两个前体的代谢不平衡，导致紫檀芪的合成效率低。为此，本项目针对以上两个问题，在已有工作基础上，对外源合成途径进行定向进化、TIGR调控和染色体进化，从蛋白和途径水平对途径进行优化和改造，创建高效新颖的外源合成途径；采用基于丙二酰辅酶A和（或）L-酪氨酸传感器的动态调控装置，调控两个前体的平衡供给，促进紫檀芪在重组大肠杆菌中的高效合成。本项目的研究思路和结果将为其它营养化学品的微生物细胞工厂的调控研究提供方法和理论上的参考。

紫檀芪是白藜芦醇的甲基化衍生物，化学结构具有更强的稳定性和生物活性，其作为营养化学品和精细化工品具有广泛的应用价值。重组大肠杆菌发酵法是替代植物提取法和化学合成法实现绿色、可持续生产紫檀芪的重要方法。然而，外源合成途径效率低以及丙二酰辅酶A和对香豆酰辅酶A两个前体的代谢不平衡，导致重组大肠杆菌紫檀芪的合成效率低。为此，项目先利用易错PCR对外源合成途径Rgtal-At4cl和Vvrs-Vvromt进行定向进化，使工程菌48h摇瓶发酵从头合成紫檀芪产量由2.39 mg/L提高到32.75 mg/L，提高了13.7倍的生产能力，创建了高效新颖的外源合成途径。其中，RgTAL突变位点为L162L (CTA-CTT)、A223A (GCA-GCG)、P298P (CCA-CCG)，At4CL突变位点为Q15Q (CAG-CAA)、L57I (CTA-ATA)、L460H (CTT-CAT)，VvRS突变位点为T50I (ACT-ATT)、V170A(GTC-GCC)，VvROMT突变位点为G6G (GGT-GGG)、S29P(TCA-CCA)、V98V(GTT-GTC)、H159H(CAT-CAC)。通过对工程菌进行ARTP诱变、易错PCR全基因组重排、对L-酪氨酸和丙二酰辅酶A代谢系统进行基因敲除，调控两个前体L-酪氨酸和丙二酰辅酶A的代谢，工程菌48h摇瓶发酵从头合成紫檀芪产量提高至115.85 mg/L，提高了3.5倍的生产能力。研究成果比已报道论文的产量均要高，成果具有一定的创新性，研究思路和结果将为其它营养化学品的微生物细胞工厂的调控研究提供方法和理论上的参考。项目在研期间，发表中科院分区2 区或以上的SCI论文7篇，中文期刊论文1篇，申请了国家发明专利3项。协助培养了博士后1人，博士研究生2人，培养硕士研究生3人。