基于液相质谱联用的重金属对DNA损伤和表观遗传修饰影响的研究

With rapid economic development, heavy metal pollution has emerged as one of the most serious environment problems. However, mechanistic studies of heavy metal toxicity at the molecular (e.g. nucleic acids) level are still lacking and the individual and synergistic roles of different heavy metal species have not been clearly elucidated. This project aims to develop a quantitative LC-MS method, in conjunction with biological analysis, to explore the interplay among heavy metal species, oxidative stress, DNA damages and epigenetic modifications. The project is designed to (1) prepare a series of isotope-labeled nucleoside standards and establish a robust LC-MS method to probe oxidative stress and epigenetic changes; (2) correlate the heavy metal species with oxidative stress, DNA damages and epigenetic modifications; and (3) elucidate the roles of different heavy metal species in the observed cytotoxic and genotoxic effects. The project will contribute to the fundamental understanding of heavy metal toxicity and provide experimental methods for environmental risk assessments and therapeutic remedies of diseases induced by heavy metals.

随着经济的快速发展，重金属污染已成为中国非常严重的环境问题之一。但在分子层面(如核苷酸层面)上对重金属的毒理研究仍不深入，且对各重金属物类的单一和协同作用了解尚不清晰。本项目拟采用液相色谱-质谱联用技术，建立一种基于同位素稀释的精确定量DNA损伤和表观遗传修饰的质谱方法。在此基础上，结合彗星实验、基因组测序、荧光实时定量PCR等生物分析方法，探讨重金属引起的氧化应激、DNA损伤和表观遗传修饰的关系。从DNA层面研究单一和多种重金属物类对生物体的毒理效应，并解析各重金属物类间的相互作用。本项目的研究结果将对重金属毒理的基础研究和研究方法做出贡献，为评估重金属的环境风险和治疗其导致的疾病提供实验支撑。

重金属污染已成为非常严重的环境问题之一。本项目建立一种兼具高效分离与精确定量的 液相质谱联用方法，用于测定金属离子在DNA层面导致的生物效应。主要研究不同金属离子对氧化应激中脂质过氧化导致的DNA 损伤标志物（εdA 和 εdG）和三个表观遗传修饰物 （5-mdC、5-hmdC 和 N6-mdA）的影响，并与生物、化学分析手段相互印证。本项目也采用表面等离子共振分析方法检测DNA生物标志物与蛋白或细胞的相互作用。.（1）采用同位素稀释法和多反应监测方式（MRM）建立和优化液相质谱联用方法，并使用CCK-8，荧光定量PCR分析不同金属离子对细胞的毒性和DNA甲基转移酶的调控。研究发现Zn2+几乎不改变三种 DNMT 的表达，Cd2+和 Fe3+提高 DNMT3A 的表达， 并且 Cd2+提高程度更大，Cu2+主要提升 DNMT1 的表达。金属离子与多肽结合后，多肽会改变金属离子的氧化还原活性进而导致细胞代谢的变化。研究发现生物体多肽与金属离子的结合能力越强，其对金属的氧化还原活性抑制越强，进而减少金属离子诱发氧化应激而产生的细胞毒性。.（2）运用表面等离子共振，建立一种快速可再生的检测生物标志物的方法。使用此方法，并结合程序设置的自动进样器，项目实现了对生物样本抗体、抗体-病毒复合物和游离病毒的自动检测。此方法对后续DNA损伤和表观遗传修饰物与蛋白质或多肽的结合动力学。.（3）使用双通道微流控装置，通过在聚乙二醇上再吸附聚赖氨酸，改进了表面等离子显微镜分析中非特异性吸附导致的背景干扰扣除方法，能更好的分析配体分子与细胞的相互作用。此方法为DNA损伤或修饰物-蛋白质的复合体与细胞的相互作用研究提供基础。.此项目建立了一些生物分析的方法，在此基础上将更好地研究后续重金属离子的生物学效应。