Sonic hedgehog信号通路促进卵巢癌转移机制研究及靶向治疗

转移是卵巢癌患者最主要死因，对于其分子机制的深入研究才能为阻断卵巢癌转移提供新的靶标。由于肿瘤转移与胚胎发育的诸多相似性，调控胚胎发育的hedgehog（Hh）信号通路在肿瘤转移中的作用日渐受到重视。我们前期工作中检测到卵巢癌细胞株和组织中均有Hh信号通路分子的表达，多项体内外实验显示Hh信号通路对小鼠角膜移植瘤周围淋巴管和斑马鱼胚胎淋巴管生成均有促进作用。在此基础上，本项目将采用Lentivirus表达载体将SHH和Gli-SiRNA分别转染卵巢癌细胞中，验证卵巢癌中Hh是否通过自分泌方式调控Gli1靶基因Snail的表达，进而调控EMT并促进转移；同时还将利用LCM、卵巢癌细胞与淋巴内皮细胞共培养模型、裸鼠卵巢癌原位移植模型等，验证Hh信号通路在卵巢癌中是否通过旁分泌作用瘤周间质细胞，促进瘤周淋巴管生成和淋巴道转移，以及Hh信号通路抑制剂联合卡铂能否有效阻断卵巢癌转移。

Hedgehog（Hh） 信号通路在胚胎时期的细胞生长分化发挥重要作用。最近研究发现在人类多种肿瘤中Hh信号通路也起着至关重要的作用。卵巢癌细胞株和组织中均有Hh信号通路分子的表达，多项体内外实验显示Hh信号通路对小鼠角膜移植瘤周围淋巴管和斑马鱼胚胎淋巴管生产均有促进作用。在此基础上提出实验假设一，卵巢癌细胞自分泌SHH，通过调控转录因子Snail 表达调控EMT，促进肿瘤侵袭转移；实验假设二，卵巢癌细胞通过SHH旁分泌方式，改变肿瘤微环境，促进卵巢癌肿瘤间质淋巴管生产和淋巴道转移。本研究分为两部分，我们应用Hh信号通路抑制剂环靶明Cyclopamine作用于卵巢癌细胞株后，免疫荧光、MTT、划痕实验、Transwell 小室检测形态、增殖、迁移、侵袭能力；运用RT-PCR，Western Blot等方法检测上皮间质化分子标志E-钙黏蛋白E-cadherin，波形蛋白Vimentin表达水平的改变。利用组织原代分离培养技术分离肿瘤相关成纤维细胞（CAF），SHH配体作用于CAF细胞后，免疫荧光、RT-PCR、Western Blot检测CAF的Gli-1、PTCH和VEGF-C的表达。淋巴管内皮细胞三维体外成管实验探究Hh信号通路在卵巢癌通过旁分泌作用肿瘤相关成纤维细胞，促进瘤周淋巴管生成和淋巴道转移。我们发现在卵巢癌细胞株中Hh信号通路核转录因子Gli-1与上皮间质化因子在卵巢癌细胞株的表达有相关性，Cyclopamine作用于卵巢癌细胞株后明显抑制了卵巢癌细胞的增值迁移侵袭能力；肿瘤细胞旁分泌SHH作用于肿瘤相关成纤维细胞，促进CAF分泌VEGF-C，促进淋巴管内皮细胞的迁移成管。本项目明确了Hh信号通路促进卵巢癌转移的分子机制，为将来Hh通路抑制剂在卵巢癌中得临床实验提供必需的实验数据。