叶绿素酶和脱镁叶绿酸水解酶在小麦叶片衰老过程中的作用

The senescence of flag leaf and grain filling in wheat are synchronous. Premature senescence of flag leaf severely affected on wheat yield. Chlorophyll degradation is the main indicator of leaf senescence. It is of great importance to analyze chlorophyll degradation pathway for exploring the mechanism of the senescence and delaying the aging process in wheat. In the project, the activities of chlorophyllase and pheophytinase and the expression of TaCLH and TaPPH genes will be analyzed during diploid and hexaploid wheat leaf senescence. At the same time, TaPPH gene will be cloned and its function will be verificated by transformation of stay-green mutant pph-1 in Arabidopsis. And then TaPPH gene in diploid wheat will be silenced and overexpressed. The activities of chlorophyllase and pheophytinase and the expression of TaCLH and TaPPH genes in mutent and wild lines will be analyzed again. Based on these results, The function of chlorophyllase and pheophytinase in chlorophyll degradation pathway during wheat leaf senescence will be clear. This will provide theoritical basis for artificially controlling of chlorophyll degradation and breeding high yield wheat varieties.

小麦旗叶衰老与籽粒灌浆成熟同步进行，旗叶过早衰老严重影响小麦产量，而叶绿素降解是叶片衰老的主要标志，解析小麦叶片衰老过程中叶绿素降解途径，对于揭示小麦叶片衰老机制、延缓衰老进程具有十分重要的意义。本项目首先分析二倍体和六倍体普通小麦叶片衰老过程中，叶绿素酶(CLH) 和脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(PPH)的酶活变化和相关基因表达特征；同时克隆小麦脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶基因TaPPH, 通过转化拟南芥滞绿突变体pph-1进行功能验证，然后沉默和过量表达二倍体小麦TaPPH基因，再分析RNAi株系和超表达株系叶绿素含量和功能绿叶面积的变化，检测其CLH和PPH酶活变化特征和相关基因表达特征以及与野生型的差异，明确小麦叶片衰老过程中叶绿素酶(CLH) 和脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(PPH)的作用，为实现叶绿素降解的人工控制，选育高产优质小麦品种提供理论基础。

叶绿素降解是从叶绿素a开始的，叶绿素a的降解存在2条途径，一是在叶绿素酶（chlorophyllase，CLH）的作用下先脱植基，生成脱植基叶绿素a，然后再脱镁；另一条是先脱镁，生成脱镁叶绿素a，再在脱镁叶绿酸水解酶（pheophytinase，PPH）作用下脱植基；小麦叶绿素的降解究竟采取哪条途径呢？还是这2条途径都存在呢? 针对此关键问题，（1）项目首先解析了二倍体、四倍体和六倍体普通小麦的衰老特征，发现不同倍性小麦衰老均呈倒“S”型曲线，但二倍体小麦衰老终止要早于四倍体和六倍体。（2）对叶片衰老（灌浆）过程中，不同倍性小麦品种CLH和PPH的酶活变化特征和相关基因表达特征进行了研究，发现脱镁叶绿酸水解酶基因（TaPPH）与叶绿素酶基因（TaCLH）在小麦花后旗叶叶绿素降解过程中协同表达，共同对叶绿素的降解发挥作用，但TaPPH的作用大于TaCLH。（3）克隆了TaPPH基因，定位于第7连锁群，TaPPH-7A、TaPPH-7B和TaPPH-7D cDNA全长分别为1467bp、1464bp和1467bp，基因组全长分别为4479bp、4313bp、4066bp，均包含5个外显子和4个内含子；TaPPHs在叶片中的表达量最高，受黑暗和ABA胁迫诱导表达；亚细胞定位发现TaPPHs在叶绿体中特异表达。（4）将TaPPH-7D过表达转化拟南芥、水稻，获得转基因株系L1、L2和L3，黑暗诱导、ABA处理和田间自然衰老下，过表达株系叶片叶绿素降解均快于野生型，自然衰老条件下过表达株系结实率降低，千粒重减小；利用VIGS获得沉默小麦株系，成熟期籽粒千粒重增加，表明TaPPH在小麦叶绿素降解过程中发挥着重要作用。（5）利用荧光素酶互补试验和双分子荧光互补试验研究叶绿素降解过程相关酶基因之间的互作，发现小麦TaPPH与TaCLH具有很强的互作，与持绿基因（TaSGR）不互作，进一步说明TaPPH与TaCLH共同参与叶绿素的降解，为解析小麦叶绿素降解机制提供了信息。.此外，根据TaPPH-7A在1299bp位点存在的SNP（A/G）开发了1个dCAPS标记，该标记将品种资源分为TaPPH-7A-1和TaPPH-7A-2两种单倍型。关联分析发现TaPPH-7A-1单倍型，在多个环境下都与高千粒重关联，为优异单倍型，为标记辅助选育高千粒重品种提供了标记基础