新型模块化分子诊断技术的设计与实现

目前的分子诊断学高度依赖于PCR技术，其他技术由于不能对信号进行指数放大，而无法检测低浓度分子。我们前期创建了能够自我激活的蛋白酶信号放大系统，可以应用于一种全新的不依赖于PCR技术的，新型模块化基因诊断技术。由此提出：根据不同领域的最新研究成果可以建立分子识别模块，信号放大模块和信号检测模块，并将这三个模块集成在一起而形成新一代通用基因诊断技术。本课题将重点建立HBV-DNA的定量检测方法，在此基础上，研究通过更换不同的分子识别模块，建立新型通用的基因诊断技术，可以满足临床实验室要求的快速、简单、高灵敏度，高特异性的实验方法。为多种传染性或者非传染性疾病筛查和监控提供一种快速灵敏而且低成本的工具。有着重要的经济价值和社会意义。

本研究采用基因工程重组技术，对离子依赖型核酸酶以及HRV3C蛋白酶和TEV蛋白酶进行结构重组，构建能够检测的特定靶分子的信号放大系统，用于核酸和离子的检测。.本研究首次构建：.（1）基于铅离子特异性DNA酶检测人体全血铅的系统，并对该系统的方法学进行了评价，经过与传统的较为复杂的石墨炉原子吸收光谱法比对，两种方法检测结果具有良好相关性，从而确认了建立的新型核酸酶传感器检测方法可以快速、准确地对血铅进行定量分析。.（2）基于HRV3C蛋白酶的信号放大系统共构建了4个系列，19种不同序列的酶原重组体，其中多数重组酶原在蛋白纯化过程中自我激活，并呈蛋白酶浓度依赖性；只有HRV 3C-Rev-106,107可在激活后随时间延长发生自我激活放大效应。.（3）基于TEV蛋白酶的信号放大系统构建了3个系列， 21种不同序列的酶原重组体，除TEV-Rev14-222重组蛋白酶原可用于信号放大系统的建立外，其余重组体均呈无法激活状态或者在纯化过程中自我激活。.（4）研究还发现TEV蛋白酶的N端片段在缺乏半胱氨酸活性中心的情况下，能够与其他蛋白的半胱氨酸结合，形成活性中心，并具有酶切活性，为蛋白酶的生物进化提供了新的机制。.（5）通过构建能够识别CMV病毒核酸序列的锌指蛋白，建立了核酸检测方法，并与传统的PCR方法进行了比较，但是灵敏度方面尚有待提高。上述结果实现了我们提出可通过自我激活的酶原构建信号放大系统的模型，为分子诊断学提供一个检测平台。