球形芽胞杆菌ICEBsph1的鉴定及对杀蚊毒素基因binA/binB的水平传播分析

Lysinibacillus sphaericus has been used successfully for the biological control of mosquito-born diseases due to the sporulation-specific binary toxin (BinA/BinB proteins). However, the evolution of binA/binB remains unclear. It is the first time that we recently found that binary toxin encoding genes (binA/binB) are located within a 35 kb DNA fragment, which has different copies and varying genomic locations amongst the different L. sphaericus isolates, and should be an integrative and conjugative element (ICE) according to its sequence characters. Therefore, we hypothesized that the origin of binA/binB be related with the horizontal transmission of the ICE (named ICEBsph1). L. sphaericus C3-41 is a highly mosquito-toxic strain isolated in China by our group which harbors two copies of ICEBsph1 (both on chromosome and on plasmid). The study plans to 1) characterize the ICEBsph1 of C3-41 by evaluate its excision/circularization and conjugative transfer capability, 2) construct L. sphaericus C3-41 mutants bearing disruptions of either chromosomal- or plasmid-born ICEBsph1, and 3) analysis the effect of the transmission and duplication of binA/binB mediated by ICEBsph1 on the physiology and mosquitocidal activity of L. sphaericus and closely related species. The research will be of importance for further understanding the diversity and evolution of mosquitocidal bacteria and for providing new direction on the genetic engineering for biopesticide for the control of disease-transmitting mosquitoes.

球形芽胞杆菌已成功用于疾病媒介蚊虫的生物防治，其杀蚊毒力主要来源于二元毒素BinA/BinB，但目前对该毒素基因进化研究较少。我们首次发现binA/binB位于一个35 kb具有整合型接合转移因子（ICE）序列特征的片段中，且该片段在种群中具有不同的拷贝数和基因组定位，因此推测binA/binB的来源可能与该ICE（命名ICEBsph1）的水平传播相关。本研究拟以自主分离具有ICEBsph1双拷贝（位于染色体和质粒上）的高毒菌株C3-41为对象，验证ICEBsph1的剪除和环化及水平转移能力；通过敲除C3-41中ICEBsph1在染色体和/或质粒上的拷贝， 以及通过ICEBsph1的介导模拟binA/binB在球形芽胞杆菌种群和近缘物种中的水平传播，解析其水平传播和多拷贝化对菌株生理生化和杀蚊毒力的影响。该研究对深入了解杀蚊细菌的进化、生态多样性及促进遗传改良具有重要的理论和实际应用价值。

赖氨酸球形芽胞杆菌已成功用于疾病媒介蚊虫的生物防治，其杀蚊毒力主要来源于二元毒素BinA/BinB，但目前对该毒素基因进化研究较少。我们首次发现binA/binB位于一个35 kb具有整合型接合转移因子（ICE）序列特征的片段中，且该片段在种群中具有不同的拷贝数和基因组定位，因此推测binA/binB的来源可能与该ICE（命名ICEBsph1）的水平传播相关。本研究主要研究内容是：1）以自主分离具有ICEBsph1双拷贝（位于染色体和质粒上）的高毒菌株C3-41为对象，验证ICEBsph1的剪除和环化及水平转移能力；2）通过敲除C3-41中ICEBsph1在染色体和/或质粒上的拷贝， 以及3）通过ICEBsph1的介导模拟binA/binB在赖氨酸球形芽胞杆菌种群和近缘物种中的水平传播，解析其水平传播和多拷贝化对菌株生理生化和杀蚊毒力的影响。所取得的研究成果:完成了ICEBsph1在赖氨酸球形芽胞杆菌中的分布和遗传结构分析，发现其主要分布于对蚊虫具有较高毒性的分离株中，但只有C3-41中存在双拷贝，且双拷贝有利于毒素更高水平的表达；识别了ICEBsph1特异性的attL、attR、attI和attB序列信息；验证了ICEBsph1在不同条件下的切除和环化的能力，发现培养基的营养成分和菌体的培养时期与其他因子(pH值、温度、紫外和化学诱变)相比对ICEBsph1的切除和环化效率影响更明显；在分析ICEBsph1的诱导时，首次分离出赖氨酸球形芽胞杆菌噬菌体，发现该噬菌体属于Myoviridae家族，在宿主种群中以假性溶源的状态存在，在细菌分裂中不对称分配，并发现该噬菌体对ICEBsph1不具有转导能力；发现ICEBsph1不具有种内或种间水平转移能力；但是首次发现C3-41的大质粒pBsph能够在赖氨酸球形芽胞杆菌属内中以ssDNA的方式进行接合转移；在C3-41无质粒消除株中转移效率比在其他高毒株和无毒株受体中效率高3~5个log数量级。ICEBsph1能够随pBsph的水平转移而转移， 并在新的宿主中脱落环化。生物信息学分析显示pBsph是一个新型Type IV型结合转移质粒。该研究对深入了解杀蚊细菌的进化、生态多样性及促进遗传改良具有重要的理论和实际应用价值。