miR-195调控NLRX1介导肠道病毒71型致神经细胞焦亡的机制研究

Our previous experiments indicate that pyroptosis was the main means of neural cell lesions induced by enterovirus 71 (EV71). Expression of miR-195 decreased while its bioinformatically predicted pyroptosis-related target, nucleotide oligomerization domain-like receptor X1(NLRX1), increased. We supposed that neural cell pyroptosis induced by EV71 infection was mediated by miR-195-regulated NLRX1. In this study, we will firstly further confirm pyroptosis of neural cells induced by EV71 infection through cellular and animal model. Then, the roles of NLRX1 will be explored by interfering NLRX1 expression in neural cells. Finally, effects of interfering miR-195 expression in neural cells and mouse brain on pyroptosis will be evaluated. Based on the research results from cellular and animal level, this project aims to ascertain the effect of pyroptosis on neural cell lesions induced by EV71 infection and the roles of miR-195-regulated NLRX1. We hope to provide the theoretical basis and clue for new therapeutic targets of neurological complications causing by EV71 infection.

我们的前期研究提示焦亡可能是肠道病毒71型（EV71）感染导致神经细胞病变的重要方式，且miR-195在感染的神经细胞表达下降，生物信息学预测其下游靶标焦亡相关基因NLRX1的表达上升。由此我们提出假说：miR-195通过调控NLRX1影响EV71导致的神经细胞焦亡。本研究将在细胞及乳鼠模型进一步验证EV71感染导致神经细胞焦亡基础上，应用EV71感染NLRX1干预的神经细胞探讨NLRX1在EV71感染导致神经细胞焦亡中的作用；并以双萤光素酶报告实验确认miR-195与NLRX1之间的结合；通过干预神经细胞及小鼠脑内miR-195的表达，观察EV71感染对NLRX1表达和神经细胞焦亡的影响。综合分析体内外实验结果，最终阐明miR-195通过调控NLRX1参与EV71感染诱导神经细胞焦亡的分子机制，为寻求EV71感染所致神经系统并发症的治疗靶点研究提供理论依据和线索。

肠道病毒EV71感染可引起手足口病，甚至致死性的脑膜脑炎。然而，由于缺乏对EV71导致神经系统疾病机制的深入理解，阻碍了治疗药物的研发。通过建立不同致病性的EV71及其他肠道感染细胞及乳鼠模型，探讨细胞焦亡发生情况，并研究miR-195-NLRX1信号通路在调控神经细胞焦亡中的作用。结果发现：1.EV71感染后SH-SY5Y细胞可导致多样的细胞死亡，包括凋亡、坏死及其他方式的死亡。激活caspase-1、IL-1β、IL-18的表达，通过阻断caspase-1的激活可显著降低EV71导致的细胞死亡、膜破裂、DNA断裂，而这些特征均为细胞焦亡发生的标志物。因而，研究结果清晰表明，EV71感染可引起SH-SY5Y发生焦亡，焦亡是EV71感染导致神经细胞病变的一个重要途径。2.EV71、B组柯萨奇病毒和Echo病毒均可以诱导SH-SY5Y细胞的焦亡。B组柯萨奇病毒和Echo病毒诱导的细胞焦亡比EV71更严重。A组柯萨奇病毒中只有CA10型毒株GD03能诱导SH-SY5Y细胞焦亡，且程度较轻。3.分离自重症和普通手足口病例的EV71毒株均可引起RD、SW1088 及SH-SY5Y细胞发生明显的焦亡。其中分离自重症手足口病例的EV71毒株较分离自普通手足口病例的EV71毒株引起的焦亡更为严重。4.EV71感染后导致多种miRNA表达失调，其中miR-195表达下降，miR-195下游靶标炎症小体NLRX1表达升高。通过siRNA下调NLRX1可抑制EV71感染后导致的细胞焦亡。双萤光素酶证实miR-195可与NLRX1直接结合，过表达miR-195模拟剂可降低NLRX1表达从而抑制EV71感染后导致的细胞焦亡。5.成功建立EV71感染乳鼠模型，EV71感染可引起乳鼠脑caspase-1、IL-1β、IL-18表达升高，提示EV71感染导致乳鼠发生细胞焦亡。本研究揭示了肠道病毒对各种细胞包括神经细胞的致焦亡效应特征，发现了miR-195 通过NLRX1从而调控神经细胞焦亡发生的机制，为EV71感染导致的神经系统并发症的治疗靶点研究提供理论依据和线索。