增加高通量DNA测序阅读长度方法研究

本项目依据具有自主知识产权的循环测序法原理，提出增加序列测定阅读长度的两个新策略，发展我国的高通量DNA 测序技术。在"延长测序引物重新定位测序起点法"中，将上一循环已经测定的一段序列作为新的测序引物的一部分，使新测序引物杂交到上次序列测定的碱基位置，重新定位测序起点开始下一轮回的序列测定；在"缩短测序模板重新定位测序起点法"中，通过限制性内切酶将已经测得DNA碱基序列的模板片段切割掉，再将模板重新连接一段测序引物杂交片段，重新定位测序起点开始下一轮回的序列测定。测序阅读长度的增加可以提高拼接组装效率、拼接序列的准确性，减少测定次数和拼接的计算量，大大降低高通量序列测定的成本。

在自然科学基金的资助下，本项目开展了以下研究工作：1）研究基于含3'-硫代次黄嘌呤脱氧核苷的寡核苷酸探针DNA高通量连接测序。该寡核苷酸探针试剂由具有知识产权新化合物（3’硫代-次黄嘌呤脱氧核苷亚磷酸酰胺）合成，在温和条件下可以被银离子定量化学裂解，并直接用于下一个循环的连接测序。利用该试剂对大肠杆菌基因组进行了高通量测序，其单向连接测序达到35个bp，完成大肠杆菌基因组99%区域的组装，其覆盖度位于15～40的之间，达到了本基金的目标；（2）研究了内切酶Ｖ识别脱氧次黄苷碱基，并利用硫代修饰核苷抑制第二个切割位点的方法将连接探针的标记物切除掉，以进行下一轮的连接测序反应。通过引入硫代修饰核苷，大大降低了非同步测序引物量，能够有效实施5个循环测序反应，即准确测序读长可以达到25个碱基，比国外报道的类似方法增加了10碱基长度；（3）研究了α-硫代合成测序方法，即利用外切酶III沿3'→5'切除单核苷酸，但不能切割硫代磷酸酯键的原理，首先加入荧光标记的天然核苷酸进行合成测序；核酸外切酶III切除上次合成反应延伸的核苷酸；加入碱基相同的α-硫代磷酸核苷酸填充切割的核苷酸；从而实现了对DNA模板的连续测序。