Graves病新生耐受模型的优化及机制研究

On the basis of previously successful induction of immunotolerance against Graves' disease in neonatal mice, the best way of tolerance establishment will be defined by evaluation of the efficiency of different dosage of adenovirus expressing TSHR A subunit for inducing immunotolerance against Graves' disease, and its possible mechanism will be explored by analysis of the expression of Aire gene in different organs, change of Th subgroups and Treg amount and function, as well as balance shift of Th1/Th2/Th17/Treg. The effect of Aire gene on prevention of Graves' disease in neonatal tolerance will be further explored by investigation of the relationship between Aire deletion and the immune response correspondingly using Aire knockout mice. This project is designed to further broaden the width and depth of our previous work, which is of important theoretical value and wide application prospects. Research findings will radiation to the prevention and treatment of all autoimmune disease.

本项目是在前期成功诱导新生小鼠免疫耐受预防Graves病基础上，以耐受剂量和方式为参考，将表达TSHR A亚单位的重组腺病毒分别设3种不同剂量肌肉注射新生雌性BALB/c小鼠，成年后诱导Graves病发生，观察耐受诱导效果，分析Aire基因在不同免疫器官和组织的表达情况、Th亚群比例及Treg细胞数目、功能变化、Th1/Th2/Th17/Treg平衡转换，探索诱导新生耐受预防Graves病的最佳方式及可能机制。以Aire基因敲除小鼠为工具，选择最佳剂量诱导新生耐受，观察Aire缺失对新生耐受诱导的影响，研究不同时期不同免疫器官、组织Aire基因表达和相应免疫反应变化的关联，进一步探索Aire基因在调节新生耐受预防Graves病中的作用。本课题是在前期研究工作基础上的进一步拓展和深化，并将会辐射至整个自身免疫性疾病的预防和治疗，其研究成果具有重要的理论价值和广阔的应用前景。

Graves病为一种常见的具有遗传倾向的自身免疫性疾病，该病主要由于机体免疫系统对自身成分促甲状腺素受体（thyroid stimulating hormone receptor, TSHR）发生免疫应答产生其抗体所致。目前尚无针对病因治疗的方法。诱导新生耐受有可能成为预防Graves病的一条有效途径，而Aire在成年耐受中起着一定作用。因此，本项目在前期成功诱导新生小鼠免疫耐受预防Graves病基础上，构建、扩增、纯化表达TSHR A亚单位的重组腺病毒（Ad-TSHR289），再以不同剂量Ad-TSHR289预处理0-3天的雌性BALB/c小鼠，成年后诱导Graves病发生，观察耐受诱导效果，结果再次证明注射剂量及诱导时间在新生耐受建立过程中起着重要作用。为了进一步探索新生耐受的机制，首先开始繁殖Aire基因敲除小鼠，分别获取Aire+/+、Aire+/-、Aire-/-新生小鼠，选择最佳剂量预处理不同组的新生小鼠，观察成年后耐受对Graves病诱导的预防作用，结果显示Ad-TSHR289及对照病毒预处理的Aire-/-新生小鼠、TRAb、TT4的平均水平均明显升高，两组之间相比较无明显差异，Ad-TSHR289预处理的Aire+/+新生小鼠和Aire-/- 、Aire+/-相比较TRAb、TT4平均水平明显降低，Aire-/-比 对照病毒预处理的Aire+/+小鼠TSHR抗体及甲状腺素水平更高些，但差异无统计学意义。所有发生甲亢的小鼠均出现了甲状腺组织的增生。小鼠脾脏Th1/Th2/Th17/Treg相关细胞因子流式检测显示Aire+/+耐受小鼠CD4+Foxp3+/CD4+、IL-4+/CD4+细胞比例水平较其它组明显增高，但各组间IFN-γ/CD4+、IL-17A+/CD4+比例无显著性差异。此外，在Th17/Treg相关基因表达水平的测定中，Aire+/+耐受小鼠脾细胞的Foxp3mRNA明显高于其它组，而TGFβ、RORγmRNA和其它组之间差异无统计学意义。由此提示：AIRE基因在新生耐受诱导过程中起着重要作用，而耐受小鼠机体免疫反应以Treg和Th2上调为主。该研究探索了诱导新生耐受预防Graves病的最佳方式及可能机制。以及Aire基因在新生耐受中的作用。本课题是在前期研究工作基础上的进一步拓展和深化，其研究成果将来有可能应用于人类Graves病的