TGF-β1/Smad4信号通路在蚕豆上调草鱼肌肉I型胶原表达中的作用机制

Crisp grass carp are those broadbean-feeding grass carp with higher elasticity,when grass carp of 1–1.5 kg are solely fed broadbean for 100 days, the muscle elasticity of these fish are much higher than those of normal grass carp. It was found in our previous study that, during the tranformation from normal grass carp to crisp grass carp, the expressions of both TGF-β1(cytokine) and Smad4 (a critical transduction factor for signal pathways) were increased simultaneously with the expression of type I collagen, and the expression of type I collagen was suppressed by interference of antisense Smad4. So, this application hypothesizes "broadbean up-regulates the expression of type I collagen in grass carp muscle possibly based on the TGF-β1/Smad4 signal pathway". And we will construct the RNAi expression vector and eukaryotic expression vector for TGF-β1 and Smad4 , in the cell and in vivo, (1) after silencing and over-expressing TGF-β1, the expressions of type I collagen and Smad4 are detected; (2) after silencing and over-expressing Smad4, the expressions of type I collagen and TGF-β1 are detected; (3) further, the expressions of type I collagen, TGF-β1 receptor 1 and 2, Smad2, Smad3 and protein phosphorylations of Smad2 and Smad3 are detected, and the functional mechanism of TGF-β1/Smad4 signal pathway will be analyzed in the up-regulated expression of type I collagen in the crisp grass carp using these data abtained above. Our results will lay the foundation for the study of the regulation of type I collagen in the fish muscle.

草鱼按照一定规程投喂蚕豆后肌肉韧性增大，成为具有一定产业规模的特色养殖对象，被称为脆肉鲩。本团队前期研究发现，在脆肉鲩培育过程中，细胞因子TGF-β1、信号通路关键传导因子Smad4的表达均与Ⅰ型胶原表达同步增加，反义基因干扰Smad4后Ⅰ型胶原表达受到抑制。由此，本申请提出“蚕豆可能经由TGF-β1/Smad4信号通路上调草鱼肌肉Ⅰ型胶原的表达”这一理论假说，并拟在细胞水平和在体水平，（1）过表达、RNA干扰沉默TGF-β1，测定Ⅰ型胶原和Smad4的mRNA量及蛋白表达的差异；（2）过表达、RNA干扰沉默Smad4，测定Ⅰ型胶原和TGF-β1的mRNA量及蛋白表达变化；（3）进一步测定Tβ-RI及Tβ-RII的蛋白表达、Smad2与Smad3的蛋白表达及蛋白磷酸化，解析TGF-β1/Smad4信号通路在蚕豆上调草鱼肌肉Ⅰ型胶原表达中的分子机制，为鱼类肌肉Ⅰ型胶原的调控研究提供参考资料。

草鱼按照一定规程投喂蚕豆后肌肉韧性增大，成为具有一定产业规模的特色养殖对象，被称为脆肉鲩。本团队前期研究发现，在脆肉鲩培育过程中，细胞因子TGF-β1、信号通路关键传导因子Smad4的表达均与I型胶原表达同步增加，反义基因干扰Smad4后I型胶原表达受到抑制。本项目验证“蚕豆可能经由TGF-β1/Smad4信号通路上调草鱼肌肉I型胶原的表达”这一理论假说。（1）构建草鱼TGF-β1、Smad4基因的RNA干扰表达载体和真核过表达载体后，将表达载体转入细胞后，荧光定量检测TGF-β1、Smad4和I型胶原的相对表达量，结果显示过表达实验组草鱼TGF-β1、Smad4及I型胶原的表达量显著高于对照组，RNA干扰实验组相比于对照组Ⅰ型胶原及TGF-β1、Smad4基因的表达量较对照组显著降低（P<0.05）。（2）将RNA干扰表达载体和真核过表达载体导入脆肉鲩鱼体水平，结果发现，注射过表达载体后， Col1α1、Col1α2的mRNA和蛋白表达量均比对照组显著增高。注射RNAi载体后，第1d、2d、5d时，Col1α1、Col1α2的mRNA和蛋白表达量均低于对照组（P<0.05）。综之，Smad4是草鱼摄食蚕豆后肌肉Ⅰ型胶原增加的关键调控蛋白。（3）为了进一步发现蚕豆调控草鱼肌肉硬度的关键蛋白质，本项目分析了草鱼和脆肉鲩的蛋白质组学，结果发现，肌肉硬度增加后有99个蛋白质表达差异2倍以上，并首次构建了鱼类肌肉蛋白质-蛋白质相互作用网络图谱，该图谱包含了56个蛋白质节点，由肌纤维结构蛋白、热激反应、糖代谢和脂质代谢等组成，该图谱揭示了蚕豆调控草鱼肌肉的糖代谢和脂质代谢，而糖代谢和脂质代谢需经由热应激蛋白hspd1再导致肌肉结构变化。按照任务书指标，已完成研发内容。本项目已发表论文4篇，包括1篇SCI源论文（IF：4.26）和3篇中文，另外1篇SCI准备投稿，培养硕士研究生2名。另外，以本项目研发成果作为主要申报内容之一，获得了中国水产科学研究院科学进步一等奖，项目主持人排名第二。