过氧化亚硝基阴离子在高糖损伤小冠状动脉Kv通道功能中的作用机制研究

改善小冠状动脉舒张功能是防治糖尿病心血管并发症的重要措施之一。高糖能引起血管过氧化亚硝基阴离子（ONOO-）的增加，造成电压依赖钾通道（Kv）介导的小冠状动脉舒张功能受损，但其机制尚不明确。本研究将（1）采用pull down方法、免疫荧光细胞化学法、Western blot、实时荧光定量RT-PCR等技术检测高糖和ONOO-刺激下大鼠小冠状动脉平滑肌细胞RhoA与Rho激酶（ROCKI/II）的活性、细胞内定位表达、蛋白和基因表达；（2）在分别给与RhoA抑制剂（C3转化酶）、ROCK抑制剂（Y-27632）后，采用体外血管环灌流、膜片钳等技术，分别检测高糖和ONOO-刺激下大鼠小冠状动脉血管张力、平滑肌细胞Kv1电流、Kv1.2 和Kv1.5蛋白和基因表达的变化。本课题旨在进一步阐述氧化应激在高糖导致冠脉舒张功能受损中的重要作用，以期为减少糖尿病心血管并发症的发生寻找新的治疗靶点。

糖尿病是冠心病的重要危险因素。高血糖状态可引起血管过氧化亚硝基阴离子（peroxynitrite，ONOO-）的增加，其通过多种途径作用于血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞，最终导致心血管功能障碍。我们的前期研究证实高糖引起内源性ONOO-合成增多，导致Kv通道及冠脉舒张功能受损，本研究旨在进一步阐述RhoA/ROCK 通路是否参与了ONOO-在高糖导致冠状动脉平滑肌细胞（coronary vascular smooth muscle cells, CVSMCs）Kv功能及其介导的冠状动脉舒缩功能受损过程。研究结果发现：1、高糖可以引起大鼠冠状动脉平滑肌细胞RhoA、ROCK1、ROCK2的mRNA、蛋白表达增加及活性的增强。2、外源性ONOO-刺激可以引起RhoA、ROCK1、ROCK2活性的增强，酪氨酸硝基化水平增高，但mRNA和总蛋白水平没有显著变化。应用ONOO-清除剂尿酸后，RhoA、ROCK1、ROCK2活性和酪氨酸硝基化水平均降低。3、ONOO-刺激后，Kv1.2和Kv1.5通道的mRNA和总蛋白的表达无显著差异。免疫印迹分析显示Kv1.2的α亚单位酪氨酸硝基化水平增加。应用RhoA抑制剂C3转移酶和ROCK抑制剂Y-27632后，Kv1.2的α亚单位酪氨酸硝基化水平降低。相反，ONOO-、C3转移酶、Y-27632对Kv1.5的酪氨酸硝基化水平无显著影响。4、免疫组化显示高糖刺激后，大鼠小冠状动脉RhoA、ROCK1和ROCK2的蛋白表达均有明显升高，分别给予C3转移酶、Y-27632预处理后，RhoA、ROCK1和ROCK2的蛋白表达均有显著下降。5、HG组冠脉对4-AP的最大收缩反应以及对forskolin的最大舒张反应均显著降低，C3转移酶和Y-27632可部分改善高糖诱导的冠脉舒张及收缩功能受损。6、ONOO-刺激后，冠脉对4-AP的最大收缩反应以及对forskolin的最大舒张反应显著降低，给予尿酸预处理清除ONOO-后，冠脉舒缩功能受损得到恢复，而C3转移酶和Y-27632同样能发挥类似尿酸改善血管功能的作用。. 综上所述，本项目研究结果提示高糖和ONOO-可通过激活RhoA/ROCK信号传导通路，使大鼠CVSMCs上 的Kv1.2通道酪氨酸硝基化水平增加，最终导致大鼠小冠脉舒张及收缩功能受损。