基于BMP-Smad信号通路探讨补肾法的选择性干预调节不同牵张速度下成骨效能的机制研究

DO(distracton osteogenesis) is an important technique of limb lengthening and reconstruction in orthopaedics. However, long treatment cycle and poor new bone formation, as main accompanied problems were needed to be solved. Application of exogenous BMP is the current approach to promoting osteogenesis, but it also have many defects. Therefore, promoting synthesis of endogenous BMP and improving bioavailability of BMP are effective alternations to solve existing problems in DO. Tonifying kidney has specific facilitation to osteogenesis, and also has great potency of activating BMP-Smad signal path. But it is still unclear that by what mechanism and targets tonifying kidney works in DO. In our research, we will establish DO model of SD rats in vivo and distraction model of osteoblast in vitro, then we will observe the impacts of different applicated phases and drug concentrations and distraction speeds in tonifying kidney by evaluating osteogenic ability. And then study the protein level and gene expression of BMP-Smad signal path related ligands, receptors, inhibitor; and we also study morphology and iconography changing of callus in distracted region. So, by studying the mechanism of DO in the field of molecular biology and morphology, we will explore the optimal interventions operated in tonifying kidney, enrich the theory of differentiation of the three phases in fracture, and objectively evaluate the effect of traditional Chinese medicine in DO.

牵张成骨是骨科肢体重建的重要技术，但治疗周期长和新骨形成不佳是亟待解决的关键问题。应用外源性BMP是目前促进成骨的主要方法，但存在诸多缺陷，促进内源性BMP合成、提高生物利用度是解决问题的有效途径。补肾法促进骨形成的作用确切，对于激活BMP-smad信号通路也有巨大的潜能，但在牵张成骨中的作用靶点和调节机制尚未明确。本研究通过建立SD大鼠牵张成骨模型及Flexcell成骨细胞体外牵张模型，观察补肾法的干预时限及药物浓度对不同牵张速度下成骨效能的影响，进而通过体内、外实验研究在补肾法最佳干预条件下BMP-smad通路配体、受体、抗体的相关蛋白及基因表达及牵张区骨痂的形态学和影像学变化。研究从分子生物学及形态学角度阐明补肾法选择性干预促进牵张成骨的作用机制，探讨补肾法促进牵张成骨的最佳干预条件，创新性的运用了骨折三期辨证施治理论，有利于客观评价中医药在牵张成骨的作用。

背景：牵张成骨是骨科肢体重建的重要技术，但治疗周期长和新骨形成不佳是亟待解决的关键问题。应用外源性BMP是目前促进成骨的主要方法，但存在诸多缺陷，促进内源性BMP合成、提高生物利用度是解决问题的有效途径。补肾法促进骨形成的作用确切，对于激活BMP-smad信号通路也有巨大的潜能，但在牵张成骨中的作用靶点和调节机制尚未明确。.内容结果与数据：本研究建立一种新型SD大鼠胫骨牵张成骨模型的方法，并将其成熟运用于所有大鼠样本中，发明的牵张成骨架获得国家专利授权，并将造模方法制作了视频。80只SD大鼠,按照实验一的造模方法造模成功后，随机分为模型组、中药组、阻遏剂组及中药加阻遏剂组，牵张及用药完成后进行指标检测。通过X线、micro-CT骨扫描大体评估，与模型组、阻遏剂组比较，中药组在牵张成骨后期成骨质量和速度提高，而中药加阻遏剂组的成骨效能也明显强于阻遏剂组。与模型组比较，中药组中BMP-Smad通路的各主要因子，包括BMP2、BMP4、BMPR1A、Smad1的基因表达明显增高；与模型组比较，阻遏剂组中BMP-Smad通路的各主要因子，包括BMP2、BMP4、BMPR1A、Smad1的基因表达明显降低；Western blot检测BMP-Smad通路的各主要因子的蛋白表达，包括BMP2、BMP4、BMPR1A、p-Smad1，与模型组比较，中药组中各蛋白表达无显著差异；而与模型组比较，阻遏剂组中BMP2、BMPR1A、p-Smad1蛋白表达明显降低。在体外实验中，对大鼠成骨样细胞系培养后，采用 Flexcell 细胞牵张系统构建成骨细胞牵张体系，使用骨碎补总黄酮含药血清进行干预 24 h。结果发现12 h 及 24 h 骨碎补总黄酮各剂量组中成骨细胞数量及 ALP、BMP-2、TGF β-1 含量均明显增加，同时，与骨碎补总黄酮低剂量组比较，骨碎补总黄酮中、高剂量组成骨细胞数目及 ALP和 BMP-2 的含量增高。.科学意义：(1)实验所建立的大鼠胫骨牵张成骨模型可靠实用，具有可重复性,保证同类研究的造模。(2)体内外研究表明BMP-Smad通路是牵张成骨早中期的重要信号调节通路，骨碎补总黄酮对牵张早中期成骨质量有正向促进作用，但多个基因表达与蛋白表达量并不一致，这表明该干预过程中有其他的调控机制参与，这提示我们方向正确，但需要进一步研究。