PIRT调节痛觉相关离子通道的机理研究

PIRT is a novel membrane protein that is specifically expressed in the dorsal root ganglia and is only known to be involved in TRPV1 regulation.In this study,we will focus on how PIRT regulates other pain-related ion channels . The multiple methods were employed that they are cell culture，calcium imaging, immunostaining, animal bebaivor and electrophysiology. On the culture neurons of PIRT-/- and PIRT+/+ mice,or HEK 293 and CHO cells co-expressed PIRT,TRPM8 and other ion channels, the whole cell current or single channel current of TRPM8 channel and A-type gated potassium channel were measured and analysised under the cold temperature and chemical stimulation (menthol,icilin and acetone) were applied in oder to study how PIRT or PIRT with PIP2 participate in the excitability regulation of ion channels in periphery nerve system.We will try to answer whether PIRT is also able to regulate other TRP channels and potassium channels besides TRPV1.This study will help us to deepen understand of PIRT's function and enrich the knowledge of pain-related ion channels regulation.

PIRT是我们新发现的一种只表达在DRG神经元的膜蛋白分子，目前仅知道它能够调节TRPV1通道。本项目将研究PIRT对其它痛觉相关离子通道的调节。采用细胞培养、钙成像、免疫染色、动物行为实验、全细胞和单通道记录等技术；在分离培养的PIRT-/-和PIRT+/+DRG神经元细胞，PIRT与TRPM8和其它离子通道质粒共表达的HEK293细胞或CHO细胞模型上,研究PIRT对TRPM8和A-type 门控钾通道电流的影响；分析PIRT与TRPM8和A-type电流相关钾通道（Kv3 and Kv4等）之间的关系；观察PIRT-/-和PIRT+/+小鼠对Menthol、icilin、丙酮和低温（冷）等刺激的行为反应；探索PIRT和PIP2参与或共同参与外周神经系统中离子通道兴奋性调节的机理；增加对PIRT蛋白生理功能的了解，丰富疼痛相关离子通道调节机制的知识。

Pirt是一种膜蛋白被确定为能够调节疼痛相关的离子通道（TRPV1），但Pirt是否参与其他疼痛相关离子通道的调节？如何调节这些通道？这些问题仍然不清楚也是我们基金立项希望回答的问题。通过课题组几年的共同努力，我们已经按计划要求完成了项目规划中的各项指标，并在新的领域有了一些发现。现将我们的研究内容和取得的重要结果概述如下：.一）Pirt作为一种内源性调节蛋白参与了TRPM8功能的调节：在Pirt基因敲除的小鼠中表现出对冷刺激（零度）比正常小鼠明显迟钝；Pirt能与TRPM8共表达，但并不改变TRPM8蛋白的表达水平；Pirt基因敲除小鼠的DRG 神经元对冷刺激的百分比明显少与正常小鼠；Pirt基因和TRPM8在DRG和细胞系中共表达后，明显增加了TRPM8对温度刺激产生的电流和内向钙流。这些结果已发表在Nature Communications (2013)。.二）Pirt通过增加TRPM8通道的电导改变它的兴奋性：利用单通道记录技术研究了Pirt对TRPM8通道功能的影响，在共表达的细胞系中发现Pirt能增加TRPM8的电导，但对通道开放的概率影响不大；PIP2和Pirt共同参与了TRPM8通道功能的调节。研究结果发表在Acta Pharmacological Sinica (2016)。.三）Pirt通过TRPV1参与子宫收缩性疼痛的调节: 在诱导小鼠子宫收缩引起的疼痛行为反应中，Pirt基因敲除小鼠表现行为明显减弱；Pirt表达的神经纤维分布在子宫肌层；通过Dil逆行标记支配子宫的DRG神经元均为无髓鞘神经元，且对Cap刺激产生反应，反应强度和反应百分比在Pirt敲除小鼠中明显减少。研究结果发表在Molecular Pain (2016) 。.四）Pirt通过抑制P2X3受体减少膀胱的过度兴奋：在Pirt缺失的情况下会引起膀胱的过渡兴奋；Pirt和P2X3能够在膀胱神经纤维中共表达；Pirt对P2X3的调节作用是通过其N-末端的14氨基酸残基；Pirt-N14能明显减少膀胱的过渡兴奋。研究结果发表在Nature Communications (2015)。