乙烯诱导番茄花柄脱落过程中离区蛋白质组研究及重要调控蛋白分析

器官脱落是植物生理学与发育生物学研究的重要问题之一，目前已明确乙烯是诱导脱落的重要因素，但对于其诱导脱落的信号途径及响应蛋白的表达尚不十分清楚。本课题以番茄花柄为试材，通过优化离区蛋白提取以及双向电泳分析条件，分析自然条件与乙烯诱导条件下脱落过程中离区蛋白的时空表达情况，并对起重要调控作用的磷酸化蛋白与糖基化蛋白进行分析，构建乙烯诱导脱落过程中离区的蛋白表达谱；通过质谱鉴定与生物信息学分析，明确乙烯诱导脱落的相关蛋白群；最后，通过荧光定量PCR及免疫组织定位分析重要脱落相关蛋白在脱落过程中的表达，并对部分新鉴定的蛋白进行基因全长cDNA克隆及组织定位分析。通过上述研究，从整体上明确乙烯诱导番茄花柄脱落过程中的蛋白表达情况，分析蛋白与基因表达的关系，探讨乙烯促进脱落的作用机制，为生产上调控作物器官脱落提供理论基础。

本课题按计划完成。以番茄品种“辽园多丽”离体花柄为试材，建立了基于双向电泳的番茄花柄离区总蛋白提取与分离体系，对自然脱落过程及乙烯诱导脱落相关蛋白进行了分析，并对部分蛋白的基因表达及蛋白定位进行了研究，主要结果如下：.通过比较TCA丙酮沉淀法、Tris-HCl 法、酚法、Trizol 沉淀法、Tris-丙酮-酚法、尿素-硫脲提取法6种总蛋白提取方法在番茄花柄离区蛋白的提取效果，明确了Trizol 沉淀法为最适宜方法；优化了番茄花柄离区蛋白双向电泳分离技术，确立了最优分离体系为：IPG 胶条 pH 4-7，800ug上样量，12%聚丙烯酰胺凝胶浓度，等电聚焦时间80000vhs（17cm）。.以自然脱落0h为对照，对自然脱落与乙烯诱导脱落过程中的蛋白进行了双向电泳分析，鉴定出比对照蛋白质丰度变化在2倍以上、重复性较好的差异表达蛋白点79个。.对79个差异蛋白点进行了质谱鉴定，结果表明脱落过程中主要涉及转录因子、信号传导、乙烯生物合成、细胞壁降解、病程相关蛋白、防御蛋白等。除多聚半乳糖醛酸酶等水解酶外，鉴定出14-3-3蛋白、ASR4蛋白等一系列新的蛋白参与脱落过程。.应用二氧化钛富集技术分离到脱落过程中的磷酸化蛋白，经质谱鉴定，筛选到脱落过程中特异表达的磷酸化肽段133个，共97种蛋白，结果表明，WRKY transcription factor 6-like、SlPIN2、auxin response factor 6 (ARF6)等与脱落过程密切相关，而乙烯处理显著提高了WRKY transcription factor 6-like、SR2L、SR3L、TCP13、calcium-dependent protein kinase 5-like等蛋白的表达。以上结果也表明，钙信号系统在乙烯诱导脱落过程中起重要作用。.采用免疫蛋白定位技术对脱落密切相关的多聚半乳糖醛酸酶进行了组织定位，结果表明，该酶蛋白首先在皮层组织大量表达，且沿着离层形成方向向髓组织细胞扩展，细胞中多聚半乳糖醛酸酶蛋白显著增多，尤其是在细胞壁及膜系统上。至脱落后期，在整个离区组织中多聚半乳糖醛酸酶大量表达，除细胞壁、细胞膜外，在细胞核、液泡及细胞质中也大量存在。另外，在脱落过程中，多聚半乳糖醛酸酶在离区的近轴端与远轴端均有显著表达。