嗜盐古菌CRISPR/Cas系统与基因组稳定性机制

This project will mainly focus on the mechanism of the Hmari-subtype CRISPR/Cas system functioned in virus immunity and genome stability in the extremely halophilic archaea. First, the transcription regulation of the CRISPR, processing of the crRNA precursors, physiological and biochemical functions of the Cas proteins, will be determined by means of gene knockout, CRISPR element mutation, Northern blotting, primer extension and other molecular biology techniques. Second, the mechanisms of the impact of Cas6 (and other associated proteins) on the genomic stability as well as the cell growth will be addressed by gene knockout and complementation, Microarray, genome-wide marker frequency analysis (MFA), electron microscopy, flow cytometry analysis etc. Third, a novel halophilic archaea-virus interaction system will be established, and will be used to investigate the function and relationship of the haloarchaeal CRISPR/Cas system involved in anti-virus and genome stability. Taken together, this project will provide novel knowledge of the physiological and biochemical functions of the Hmari-subtype CRISPR/Cas system, and insights in understanding the impact and mechanism of the CRISPR/Cas system on genome replication and stability in haloarchaea.

以极端嗜盐古菌特有的Hmari亚型CRISPR/Cas系统为研究对象，通过基因敲除、CRISPR元件突变、Northern杂交、引物延伸等分子生物学技术解析CRISPR/Cas系统在嗜盐古菌中的转录调控机制、crRNA前体加工机制，以及相关Cas蛋白的生理生化功能；通过组合基因敲除/互补分析、Microarray分析、全基因组MFA分析，结合电镜观察、流式细胞仪、脉冲场电泳分析等，探索Cas6缺失引起嗜盐古菌生长和基因组稳定性变化的深层机制；构建嗜盐古菌新的病毒-宿主互作系统，分析嗜盐古菌CRISPR/Cas系统抗病毒机制与其基因组稳定性之间的关系。最终为深入理解Hmari亚型CRISPR/Cas系统的生理功能、作用机制及其与嗜盐古菌基因组复制与进化的关系提供新的知识和见解。

本项目以极端嗜盐古菌I-B型CRISPR-Cas系统为材料，围绕“CRISPR系统作用机制及其与基因组稳定性的关系”这一主题，开展了一系列基础性和开拓性的研究。代表性工作包括：1)首先通过系列分子生物学方法如引物延伸、Northern杂交、基因敲除等手段，对嗜盐古菌CRISPR系统crRNA加工成熟及其稳定性机制进行了系统解析；同时结合MFA等组学手段揭示了嗜盐古菌多位点起始控制的基因组复制机制并探索了其对基因组稳定的意义，为本项目的深入开展奠定了基础。2)在此基础上，我们利用分离到的新病毒HHPV-2，在古菌领域中成功构建了第一例宿主CRISPR从单一病毒高效获取新spacer的适应系统，发现该适应过程严格依赖“引发”机制，为理解国际上在纯病毒侵染实验中难以观察到CRISPR高效适应的现象提供了重要见解和解决方案。3）进一步通过对64种可能的PAM序列在引发适应过程中的功能研究，揭示了“PAM验证的引发机制”，首次回答了适应过程中的异己区分机制，并统一了嗜盐古菌CRISPR系统引发适应、特异干扰和特异保护三个过程。4)通过对CRISPR中leader及repeat序列的扫描突变，发现repeat内部元件介导了spacer整合反应位点的精确识别，回答了CRISPR适应过程中如何维持其repeat-spacer周期性、保证宿主DNA稳定性这一关键问题。5)在CRISPR系统Cas蛋白新功能方面，首次发现Cas6蛋白可直接切割原病毒RNA、抑制原病毒激活以保持基因组稳定性。我们近期还发现了位于CRISPR-Cas基因簇基因间区的toxin-antitoxin系统，基因敲除和DNA突变分析表明，Cas蛋白可能通过对该毒素系统的控制来维持基因组和CRISPR-Cas系统的稳定。综上所述，本项目通过对嗜盐古菌CRISPR-Cas系统工作机制的解析，在CRISPR系统对病毒适应过程的基础研究方面取得了若干重要突破，同时发现CRISPR系统不仅能够高效适应和防御外源遗传因子的入侵，而且能够调控宿主基因组内部多种可移动元件的活性，因此对维持基因组稳定性具有双重意义。相关工作已在Nucleic Acids Res, Nat Commun等高端期刊发表系列研究论文，高质量完成了项目计划。