杆状病毒核心基因gp41在BV和ODV形成过程中的作用机制研究

Known as one of the baculovirus core genes, GP41 resides in the tegument region between the envelope membrane and the capsid. Our preliminary study analysed the cellular location of AcMNPV GP41, showing it located in the ring zone close to the inner nuclear membrane. We also found that gp41 knock-out AcMNPV produced nucleocapsids were retained in nucleus, thus no BVs produced, and nucleocapsids failed to be enveloped to become matured ODVs. Bio-informatics analysis showed that GP41 possesses multiple O-glycosylation sites and phosphorylation sites, leucine zippers and one potential motif of leucing-rich nuclear export signal. All these suggested that GP41 is important for virus assembly and transport through nuclear pores. This subject is going to further investigate the structure and functions of GP41, including to construct a series of transient expression vectors and recombinant bacmids carrying GP41s with truncations and/or mutations at important sites, to characterize the influences of truncated and mutated GP41s on the cellular distribution, virus infectivity and BV and ODV morphogenesis, and to analyse the possible interactions between GP41 and the exportin (CRM1) in host cells. It is very promising to clarify the function and mechanism of GP41 in BV and ODV morphogenesis, which will be of important significance for taking baculovirus as models to further study the nuclear pore transport pathway in insect cells.

gp41是杆状病毒的核心基因，定位于ODV囊膜和核衣壳之间的皮层结构。我们的初步研究发现，AcMNPV GP41定位在细胞内核膜环带区；缺失GP41导致大量核衣壳滞留在核内无法产生BV，同时核衣壳无法正确包埋形成ODV。生物信息学分析发现，GP41含有多个 O-糖基化和磷酸化位点、亮氨酸拉链和一段富含亮氨酸的潜在核输出信号。这些证据提示，GP41很可能在病毒的装配及核孔运输过程中发挥重要作用。本项目拟深入解析GP41的结构与功能，包括：对重要结构位点进行截短和突变，构建一系列瞬时表达载体及重组病毒；分析这些突变体的亚细胞定位、对重组病毒BV和ODV感染性及形态发生的影响；通过蛋白相互作用等方法揭示GP41与宿主细胞核输出蛋白Exportin（CRM1）可能存在的相互作用。本研究有望深入解析GP41在BV、ODV形成过程中的作用，对进一步研究以杆状病毒为模型的昆虫细胞核孔运输机制有重要意义。

杆状病毒是一类古老的特异性感染昆虫的大DNA病毒，其感染周期中会产生两种不同形式的病毒颗粒，出芽型病毒BV和包埋型病毒粒子ODV。BV负责杆状病毒在昆虫体内的系统感染，ODV因有包涵体的保护，可在自然界长期存活，因此能帮助病毒在虫体间的感染传播。BV和ODV的形成机制一直是杆状病毒的研究热点之一。gp41是AcMNPV BV和ODV形成的核心基因，定位于ODV囊膜和核衣壳之间的皮层结构。目前对GP41的功能研究十分有限。早期研究构建温敏突变型重组病毒发现GP41与核衣壳的出核运输有关，对BV的形成是必需的。本项目通过构建缺失GP41的重组bacmid，首次发现缺失GP41不仅影响BV的产生，还导致ODV无法形成；验证了GP41对BV形成的必要性，也揭示了GP41对ODV形成也是必需的。细胞定位分析发现GP41聚集在细胞核内环带区，介导核衣壳与微囊泡的相互作用，是BV 和ODV形成过程中的必要事件。GP41含有5个保守半胱氨酸位点和两段类亮氨酸拉链基序，提示GP41可能存在分子间二硫键和分子间相互作用。对非还原条件下GP41的寡聚化状态研究发现GP41形成三聚体后被选择性包装到病毒粒子中。分别构建保守半胱氨酸位点和类亮氨酸拉链d位氨基酸突变的GP41的重组bacmids及转染质粒，研究这些突变GP41的寡聚化和细胞定位，通过扫描电镜和免疫电镜观察GP41突变的重组bacmids转染或重组病毒感染细胞中BV和ODV形成过程中的精细事件，揭示了GP41通过类亮氨酸拉链基序介导的分子间相互作用和分子间二硫键的共同作用寡聚化成为三聚体，从而介导BV和ODV的形成。此外，还发现和验证了宿主蛋白Ter94可与GP41直接相互作用，分析了Ter94对BV和ODV形成的重要性。综上所述，本项目揭示了GP41在AcMNPV BV和ODV形成中的重要作用，解析了GP41发挥功能的作用机制与关键功能结构域，鉴定了Ter94与GP41相互作用及在BV和ODV形成中的重要性，对进一步揭示和理解杆状病毒BV和ODV的形态发生机制有十分重要的科学意义。