鸡骨钙素通过MAPK信号通路对蛋鸡脂肪肝综合征的作用及调控机制

Fatty liver syndrome of laying hens occurs mainly in high-production cage layers. Osteocalcin(OCN) is an endocrine hormone, which is secreted by Osteoblasts. The hormone inhibits fat accumulation and regulates energy metabolism. According to some papers and our researches, we speculate that OCN is a potential hormone for prevention and combating FLS. However, the effects and regulation mechanisms of OCN on layer's FLS is not clear. In the project, OCN will be injected into experimental induced FLS layers by high energy and low protein die. And then the production performance of laying hens, fat deposition, liver peroxidation injury , liver inflammation and the variation of JNK and p38 MAPK signaling pathway will be detected using ELISA, transmission electron microscopy, Real-time PCR, western blotting and so on. In vitro, chicken hepatocyte steatosis will be induced by medical fat emulsion, and then the cells will be treated by OCN. The effect of OCN on hepatocyte steatosis, hepatocyte peroxidation damage and hepatocyte inflammtion will be analyzed using flow cytometry, transmission electron microscopy, Real-time PCR, western blotting and so on. Functions of JNK and p38 MAPK signaling pathways will be researched by their inhibitors, RNA interference and over expression. The project will be able to clarify the effects and regulation mechanisms of OCN on fatty liver syndrome in laying hens, and provide new ideas for the prevention and treatment of FLS layers.

蛋鸡脂肪肝综合征（FLS）是笼养蛋鸡常见能量代谢病之一，对养鸡业危害较大。骨钙素（OCN）是成骨细胞分泌的蛋白质，可调节能量代谢。根据文献及我们研究结果推测OCN可能是潜在的防治蛋鸡FLS的物质，但OCN如何影响FLS及调节机制并未明确。本项目拟通过高能饲料诱导蛋鸡FLS，应用ELISA、透视电镜、荧光定量PCR、蛋白免疫印迹等法研究OCN对蛋鸡生产性能、脂肪沉积、胰岛素抵抗、肝氧化损伤及炎性反应的影响，确定JNK和p38 MAPK信号通路是否在调节过程中发挥作用。在体外，通过脂肪乳诱导肝细胞脂肪化，应用流式细胞术、蛋白免疫印迹、透视电镜等方法研究OCN对肝细胞脂变、氧化损伤及炎性反应的影响；进一步应用JNK和p38 MAPK信号通路的抑制剂、RNA干扰和过表达等技术阐明信号通路在该过程中的具体调节方式。本项目可揭示OCN抵抗蛋鸡FLS的作用并阐明其机制，为减少FLS的发生提供理论依据。

蛋鸡脂肪肝综合征（FLS）是笼养蛋鸡常见营养代谢性疾病。骨钙素（OCN）是成骨细胞分泌的蛋白质，可调节能量代谢。本项目拟通过体内外实验，研究OCN在蛋鸡脂肪肝形成和肝细胞脂肪变形的调节功能及其机理。30只68周龄白色罗曼蛋鸡随机分成3组，饲养在30个笼中（n=10），分别为对照组（ND+V）、高脂日粮组（HFD+V）、高脂日粮骨钙素组HFD+OCN（2 μg/kg, 1 time/2 days, i.m.），连续饲养40天。在第30天进行葡萄糖和胰岛素耐受试验。在第40天，所有蛋鸡麻醉后采血并安乐死，生化分析蛋鸡肝功和血脂含量，采集肝脏制备肝脏组织切片，观察其显微结构和超微结构。ELISA检测血液炎性因子的含量。PCR检测肝脏脂肪因子、炎性因子、凋亡因子基因表达量。酶标仪检测肝脏的氧化损伤因子。Western-blotting分析PPAα、TNF-α和JNK信号通路的变化。体内研究结果显示给与高脂日粮可增加蛋鸡肝脏出血点、纤维化，引起肝细胞固缩、核固缩和自噬溶酶体减少。给与OCN后可减少高脂饮食引起的蛋鸡肝脏病理变化，提高胰岛素敏感性，降低肝脏MDA，提高GSH-Px的含量，降低血液中TNF-α含量和肝脏中TNF-α的基因和蛋白表达量。Western-blotting研究结果发现高脂饮食可增加肝脏p-JNK的表达，而给予OCN可降低p-JNK的表达。以体外培养的肝细胞为研究对象，通过医用脂肪乳诱导肝细胞脂变，在培养液中添加1、3和9nM浓度的OCN，研究OCN对肝细胞增殖、脂肪变性、炎性反应、氧化损伤、超微结构的影响。体外研究结果显示各浓度OCN均可不同程度的增加细胞的活性，降低脂肪乳诱导的鸡胚肝细胞脂肪沉积，降低IL-1、IL-6和TNF-α的含量，降低肝细胞中脂滴的含量，提高自噬溶酶体含量，其中以1nM OCN的效果最好。除此之外，1nM OCN可显著增加脂肪变性肝细胞中ADPN的基因表达，降低ROS含量，3nM骨钙素显著增高PPARα的基因表达。脂肪乳可导致肝细胞p-JNK的表达增加，而给予OCN可降低p-JNK的表达。在脂肪性肝细胞中添加5μM JNK抑制剂可达到与添加1nMOCN类似的效果。体内外实验说明给OCN可通过抑制JNK信号通路降低蛋鸡肝脏脂肪沉积、炎性反应、氧化损伤、氧化应激，增加脂肪因子的表达。