食管癌INK4a位点基因外显子1甲基化和羟甲基化调控机制研究

It is generally recognized that DNA promoter methylation induces tumor suppressor gene silencing, but the relationship between exon 1 methylation and gene expression is unclear; a newly found DNA hydroxymethylation. Our previous results indicated that INK4a gene（p16 and p14） promoter methylation is lower than exon1 methylation in esophageal cancer tissue, and the significant correlation is determined between gene expression and exon1 methylation; The project aims to detect different status of p16/p14 gene methylation and exon 1 hydroxymethylation in esophageal cancer tissue, to investigate molecular mechanisms of how exon 1 methylation affects gene transcription, to clarify how hydroxymethylation binding protein complex affects p16/p14 genes hydroxymethylation, This project will help to better understand the epigenetic mechanisms in esophageal cancer progression.

DNA启动子区甲基化一般认为可以导致抑癌基因沉默，而基因编码区的甲基化与基因表达的关系尚不清楚；近年来新发现的DNA羟甲基化在基因表达中的作用及机制也不明朗。我们的前期结果表明，食管癌INK4a位点基因（p16和p14）外显子1甲基化程度高于启动子区，且与基因表达明显相关；本课题通过对食管癌INK4a位点基因外显子1的甲基化和羟甲基化状态进行检测，与食管癌临床特征进行统计学分析，明确p16和p14基因外显子1甲基化及羟甲基化水平差异的临床意义。分别探讨外显子1甲基化和羟甲基化影响基因转录表达的分子机制；阐释与INK4a位点基因羟甲基化修饰结合的蛋白复合物调控羟甲基化的机制。本项目将有助于深入了解食管癌发生发展过程中的表观遗传学机制。

食管癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来其发病率在世界范围内呈日益上升的趋势，食管癌恶性程度高，预后极差。表观遗传学调控基因表达在食管癌发病中发挥重要的作用。目前关于肿瘤的表观遗传学研究多关注的是肿瘤基因启动子区的甲基化状态，对基因组编码区DNA甲基化情况的认识非常有限，第1外显子区的甲基化，可能与基因的表达调控有着更为紧密的关系，DNA羟甲基化在肿瘤基因表达中的机制也尚不明确。申请人在前期工作中发现INK4a位点基因在食管癌组织中和细胞株中表达均明显减少，食管癌组织和正常组织p14基因启动子区和外显子Exon1β区甲基化水平有着明显的不同，Exon 1β的甲基化发生率在肿瘤组织中增高，可能是食管癌的诱发因素之一。因此本项目进一步研究了p14 基因启动子及外显子1甲基化状态与基因表达水平的关系，通过分析甲基化结合蛋白在基因启动子和外显子1区的结合能力以及不同组蛋白修饰在启动子和外显子1的定位，探讨了p14 基因启动子及外显子1甲基化影响基因表达的机制，检测了食管癌及配对正常组织羟甲基化酶的表达水平并分析了基因突变对其表达的影响,通过构建干涉TET1的OE33食管癌细胞系，探讨了TET1通过改变5hmC水平调控基因表达的机制。研究结果如下：首先，随着N→T变化，p14基因编码区甲基化水平逐渐增高，编码区的甲基化水平与p14表达呈反比关系，说明编码区DNA甲基化在基因表达调控中发挥重要的作用；其次，启动子区及编码区甲基化可通过影响组蛋白H3K9、H3K27、H3K4、H3K36甲基化修饰影响基因表达；再次，p14外显子区甲基化可以促进MeCP2的结合，从而抑制其表达；最后，我们发现食管癌组织中p14启动子及Exon 1β均有羟甲基化胞嘧啶的存在，羟甲基化酶TET1，2，3在食管癌组织中与正常组织相比表达降低，基因突变是导致TET1表达改变的原因。TET1可通过影响5hmC与MeCP2的结合，进而影响HDAC2，4的招募而影响基因的表达。项目的研究丰富了启动子、外显子区甲基化以及羟甲基化与食管癌关系研究的基础理论及实践。