白藜芦醇抗肝纤维化作用新靶标及分子机制研究

Activation of HSC and EMT is the key link of progression of hepatic fibrosis, which display as expression of α-SMA and formation of cicatrix. Early days work indicate that nuclear factor Gli1 in Hedghehog（Hh）signal pathway in HSC can activate HSC. At the same time resveratrol has favourable effect of anti-hepatic fibrosis as well as restrain expression of Gli1 in HSC. It is presume that resveratrol is the micromolecule inhibitor of Hh. For this purpose,the item approach depressant effect of resveratrol on Hh signal and downstream target gene and learn more about mechanism of regulation on Hh signal pathway、activation of HSC and EMT by using the way of cell culture and animal experiment of hepatic fibrosis. The item is to solve such problems as: ①To elucidate correlation of Hh signal pathway、EMT and activation of HSC, Resolve the molecular mechanism of liver fibrosis in the Hh signaling pathway EMT; ②To establish that resveratrol produce a marked effect by regulation of Hh signal pathway then activation of HSC and EMT; ③To confirm that resveratrol is a new micromolecule inhibitor of Hh signal pathway; ④To provid experimental evidence for prevention and cure of hepatic fibrosis by combination of TCM with Western medicine especially for new drug target and mechanism of traditional Chinese drug which has marked curative effect.

HSC的活化和EMT是肝纤维化进展的核心环节,表现为表达α-SMA，形成纤维瘢痕。前期工作表明,在HSC细胞株中Hedghehog（Hh）通路中核转录因子Gli1可活化HSC。同时,还发现白藜芦醇具有良好的抗肝纤维化效应，同样也可抑制HSC中Gli1表达。故推测白藜芦醇是Hh小分子抑制剂。为此，本项目采用细胞培养及肝纤维化动物实验，探讨白藜芦醇对Hh信号及Gli1下游靶基因抑制作用，并对调控Hh信号通路和HSC活化、EMT的机制予以深入研究。拟解决以下几个问题：①阐明Hh通路、EMT和HSC活化的相关性，解析肝纤维化中Hh信号通路调控EMT的分子机制；②确立白藜芦醇是调控Hh信号通路，进而调控HSC活化、EMT而发挥作用；③证实白藜芦醇是一个新型的小分子Hh信号通路抑制剂；④运用上述结果，为探索中西医结合防治肝纤维化，尤其是对疗效显著的中药单体的新药靶及机制提供实验依据。

肝纤维化是严重威胁人类健康的重要疾病之一，迄今没有满意的治疗方法。因此，研究中药单体白藜芦醇抗肝纤维化作用及机制，具有重要的科学意义。.一. 白黎芦醇在大鼠肝纤维化模型中抗肝纤维化作用研究:建立CC14诱导的大鼠肝纤维化模型，设立正常组、模型组、RT给药组、秋水仙碱阳性对照组。结果显示，RT对CC14诱导的大鼠肝纤维化具有良好的保护作用。肝纤维化模型大鼠血清ALT、AST与正常组相比明显升高，RT治疗组转氨酶均下降，阳性对照组秋水仙碱亦能明显降低模型大鼠血清转氨酶ALT、AST。模型组HA,LN,CIV,PCIII等纤维化血清学标志物水平较正常组明显升高，给予RT可使其显著降低。RT可显著降低模型组的Hyp值。组织病理学结果表明RT可明显的抑制肝纤维化程度，改善肝组织结构，减少胶原沉积。二． 观察白藜芦醇对TGF-β1，PDGF和α-SMA表达的影响:测定活化的HSC-T6中TGF-β1，PDGF和α-SMA的表达以及白藜芦醇干预后表达的差异。结果显示，白藜芦醇可以显著降低HSC-T6中TGF-β1，PDGF和α-SMA的表达(与模型组比较P<0.01)，与信号通路各成员Shh、Patched、Smo和Gli1的表达降低一致。提示TGF-β1，PDGF和α-SMA可能是Shh-Gli1 信号通路在抗肝纤维化过程中控制的下游靶位点。三． 从细胞水平研究白藜芦醇抑制HSC-T6增殖和促进HSC-T6凋亡的作用:结果显示，白藜芦醇对HSC-T6生长有明显的抑制作用，白藜芦醇可以明显抑制HSC-T6生长(与正常组比较P<0.01)；白藜芦醇干预后HSC细胞大多停留在细胞周期G0和G1期；和对照组相比，白藜芦醇作用24小时后星状细胞的基因组DNA出现了明显的凋亡梯度改变。四． Shh-Gli1 信号通路成员Shh、Patched、Smo和Gli1在肝星状细胞HSC-T6中的表达以及白藜芦醇干预作用:测定活化的HSC-T6中Shh, Smo, Ptch, Gli-1 mRNA的表达以及白藜芦醇的干预后各基因mRNA水平表达差异，结果显示，白藜芦醇0.4 mg.L-1可以显著降低Shh-Gli1 信号通路各成员Shh、Patched、Smo和Gli1的表达(与对照组比较P<0.01)，提示白藜芦醇抗肝纤维化的作用与其影响并降低Shh-Gli1 信号通路各主要成员的表达有关。