青海湖裸鲤促性腺激素释放激素基因的结构类型、时空表达及其功能的研究

The naked carp( Gymnocypris przewalskii), which attributed to Schizothoracinae Cyprinidae in Qinghai lake of Qinghai-Tibet plateau ,be selected to sutdy as research subject in the project.According to the typical biological characteristic of slow growing and late breed maturing of the naked carp under the condition of its unique ecological environment, the technical methods of molecular biological and cell biological be used to obtain the whole gonadotrophic hormone release hormone (GnRH) cDNA in naked carp; Construction of eukaryotic expression plasmid including whole GnRH region. Finding out evidence about temporal and spatial expression characteristic of GnRH mRNA in naked carp; Obtaining the direct evidence and related data dealing with GnRH gene expression and GnRH nerve cells embryonic origin,the migration route as well as the differentiation . Aimed to define the GnRH sequences,variants and its encoding protein structure characteristic in naked carp. Exploring and investigating the GnRH gene expression patterns in cold water fish in Qinghai-Tibet plateau. Revealing the functions and action mechanisms of the neuronal groups GnRH in naked carp. This project provides the scientific evidence for solving restriction factor of slow growing and late breed maturing of cold water fish in plateau lake, promoting fish resources conservation in plateau native fish ,developing and utilizing unique fishery resources in plateau, carrying out the crossbreeding research among Schizothoracinae fish .

本项目以青藏高原青海湖中的鲤科裂腹鱼亚科鱼---青海湖裸鲤为研究对象。针对其在独特的生态环境条件下生长缓慢，繁殖成熟晚的典型生物学特性，采用分子生物学和细胞生物学等技术，获得青海湖裸鲤促性腺激素释放激素（GnRH）基因全长cDNA；构建GnRH全编码区真核表达质粒；确定青海湖裸鲤GnRH mRNA及其编码蛋白质的时空表达特征；取得裸鲤GnRH基因表达与GnRH神经细胞胚胎起源、迁移途径和分化的直接依据和相关数据。其目的在于确定裸鲤GnRH基因的序列、类型及其编码蛋白的结构特征；探讨GnRH基因在青藏高原冷水鱼中的表达规律；揭示神经细胞GnRH的功能和作用机理；为突破高原湖泊冷水鱼生长缓慢和繁殖成熟晚的瓶颈、推动高原土著鱼类的资源保护、高原特有渔业资源的开发利用和开展裂腹鱼亚科间的杂交育种研究提供科学依据。

项目的背景： .青海湖裸鲤作为裂腹鱼亚科鱼类中最具的代表性鱼种，是功能蛋白与基因研究的最佳材料。青海湖裸鲤人工繁殖取得成功，可保证从胚胎发育到生长阶段功能基因研究的系统性、全面性和连续性；.国内外学者对裂腹鱼亚科鱼类繁殖活动的功能蛋白及其基因的研究较少。因此，开展青藏高原特有裂腹鱼亚科鱼类的特殊功能蛋白及其基因研究意义重大。.青海湖裸鲤救护中心具有国家级青海湖裸鲤原种场和青海湖裸鲤人工增殖放流站。青海省裸鲤救护中心提供本项目研究用的鱼类资源和孵化场所，保证了项目实施的资源和技术支撑。.青海大学是由教育部和青海省共同建设、清华大学等知名高校对口支援的国家“211工程”重点建设大学，本实验室具有开展本项目的基本实验条件。.本项目首次对青海湖裸鲤繁殖活动相关的基因GnRH及其功能蛋白进行系统的研究，并阐述高原鱼类季节性繁殖的机理。.主要研究内容：.1.青海湖裸鲤促性腺激素释放激素(GnRH)基因全长基因及内含子的克隆及分析.2.青海湖裸鲤GnRH mRNA和蛋白水平的时空表达特征研究.3.青海湖裸鲤GnRH基因胚胎发育阶段和繁殖季节与非繁殖季节不同组织的RNA原位杂交。.4. 青海湖裸鲤GnRH繁殖活动的功能研究.重要结果：.1.实验结果证明青海湖裸鲤有两种GnRH类型。分别是GnRHⅡ和GnRHⅢ。.2.实时荧光定量证实青海湖裸鲤GnRHⅡ和GnRHⅢ 基因在繁殖季节和非繁殖季节的雄鱼和雌鱼脑组织和性腺均有差异表达。同样这两种类型基因在胚胎发育过程中也呈现不同的表达。.3.蛋白印迹证实GnRH GnRHⅡ和GnRHⅢ两种蛋白在不同季节均有差异性表达。.4.RNA原位杂交也证明在不同季节脑组织和性腺等也呈现差异性表达。.关键数据：.获得对不同季节的裸鲤雌雄脑和性腺组织的样品转录组数据。另外，运用RNAscop技术获得不同季节及雌雄鱼的组织RNA水平上的原位杂交数据。.科学意义：.通过本项目研究，可探知裸鲤GnRH分子结构进化的模式。阐述青海湖裸鲤由长期地理隔离形成的高原鱼类独特繁殖活动的机理。推动高原鱼类品种资源的保护和开发利用提供科学依据。开启高原鱼类发育生物学领域的研究之门。