基于Wnt/β-catenin通路探讨骨碎补有效成分复合可注射骨修复材料对成骨细胞增殖分化的影响

bone defects has been a clinical problem, the new bone scaffolds combining traditional Chinese medicine has been proven,although with good prospects, but the lack of repair mechanisms more in-depth study. oste0blast is a key factor in bone formation, Wnt/β-catenin pathway plays an important role in the proliferation and differentiation of OB,the Wnt pathway is a hot research path ogenesis of bone healing. Syndromes associated with traditional Chinese medicine research methods to 0B as the object, IBRC scaffold, on behalf of kidney medicine-Total Flavonoids from intervention,detect the relevant factors in the regulation of the different components of Wnt/β-catenin pathway expression on proliferation and differentiation of OB,poptosis and pathological changes,revealing effector mechanisms,explore the "kidney essence deficiency,marrow is not full"microscopic pathology and pathogenesis theory,and provide scientific and objective experimental evidence for the treatment of kidney medicine composite IBRC on clinical applications of bone defects.

骨缺损修复一直是困扰临床医生的难题，制备新型骨支架材料，结合中医药干预，疗效确切，具有良好应用前景，但修复机制缺乏深入研究。成骨细胞（oste0blast，0B）是骨形成的关键因素，Wnt/β-catenin通路在OB增殖分化方面起重要作用，调控Wnt通路是目前研究骨愈合病机的热点。采用中药与病证相关性研究方法，以0B为研究对象，可注射骨修复料（Injectable BoneRegeneration Composite,IBRC）为支架，补肾中药代表-骨碎补总黄酮干预，检测在不同组分调控Wnt/β-catenin 通路中的相关因子表达，探究骨碎补总黄酮调控附着于IBRC上的OB增殖分化的作用靶点，研究OB增殖分化、凋亡与成骨机能病理改变的关联性，揭示效应机制，探讨“肾精亏虚，髓不能满”病机理论的微观病理基础，并为补肾中药复合IBRC治疗骨缺损临床应用上提供科学客观的实验依据。

大范围骨缺损的修复是世界性难题，本课题针对这一骨科临床上棘手的问题，研究中药骨碎补总黄酮联合纳米骨材料对成骨细胞增殖分化及血管新生的体外实验，为探索中西医结合模式治疗骨缺损提供科学依据。实验内容及结果：（1）通过OTF联合nHAC材料对鼠成骨细胞的不同组别体外复合培养的初步研究，细胞增殖活性实验、细胞凋亡检测及形态学观察的结果较一致，相互验证，表明实验组细胞的良好功能状态，观察到OTF 100µg/mL和250µg/mL浓度组提高成骨细胞黏附、增殖活力最佳并保持其正常细胞形态，随着培养时间的延长，生长趋势越好，具有明显地剂量依赖和时间依赖性，（2）nHAC材料具备很好的生物相容性，对细胞无毒性，而且中药OTF复合nHAC材料能促进成骨细胞增殖，抑制凋亡，保持正常的细胞形态，但其成骨效应有待进一步研究。（3）OTF能够诱导MC3T3-E1细胞成骨分化，提高ALP活性和OCN浓度，同时升高MC3T3-E1细胞培养物中Col-Ⅰ，OPN和OCN mRNA的表达和蛋白表达水平。浓度为100µg/mL和250µg/mL的OTF可以有效促进MC3T3-E1细胞的分化、矿化。（4）通过体外培养MC3T3-E1细胞与nHAC复合体，OTF诱导培养后具有成骨细胞的活性及生物学特性，适宜作为构建组织工程骨的种子细胞和三维条件下进行细胞实验的研究对象。（5）OTF能明显促进成骨细胞的分化增殖，促进骨形成及骨矿化，并且可增加β-catenin、LRP5、RUNX2的表达，下调GSK3β的表达，可以推测OTF通过激活经典 Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞产生促进作用，这是可能作用机制之一。 （6）nHAC材料具有良好的细胞结合能力，hFOB-HUVEC在支架材料上共培养，可以良好的进行贴附、生长和增殖。（7）HUVEC的增殖活性可能与成骨细胞分泌FGF-2有关，而OTF对成骨细胞分泌FGF-2没有促进作用。本项目研究基于 Wnt/β -catenin 通路，补肾中药有效成分代表骨碎补总黄酮复合 nHAC材料对成骨细胞增殖分化作用的分子学机制，为补肾中医药复合nHAC材料治疗骨缺损临床应用上奠定客观的实验依据和应用基础，为中西医结合治疗骨折、骨坏死及脊柱融合等相关骨病提供新的思路。