m6A mRNA甲基化修饰调控TNFα合成的机理研究

TNFα is one of the most important cytokines and plays important roles in injury, repair, immune response, inflammatory response and hematopoiesis. The biological synthesis of TNFα is regulated in a variety of ways, including transcriptional initiation regulation, RNA translation regulation mediated by ARE elements, and protein level regulation, while the epigenetic modification of its mRNA level is still unclear. Recent studies have found that m6A methylation is the most abundant internal mRNA modification, which is involved in multiple processes of regulating mRNA metabolism. Through the CRISPR-Cas9 gene-screening and related databases, we found that the synthesis of TNFα may be regulated by m6A methylation. Therefore, we propose a scientific hypothesis that m6A mRNA methylation regulates the synthesis of TNFα, and affects the maintenance of immune homeostasis. This project aims to solve the following scientific problems :(1) The specific biological mechanism of m6A mRNA methylation to regulate TNFα synthesis; (2) physiological effects of TNFα synthesis regulated by m6A mRNA methylation. To answer these questions will reveal new ways and mechanisms of regulating TNFα synthesis, and provide new strategies for the treatment of TNFα related major diseases.

TNFα是最重要的细胞因子之一，在损伤、修复、免疫应答、炎症反应以及造血中担任重要角色。TNFα的生物学合成受多种方式调控，包括转录起始调控、ARE元件介导的RNA翻译调控以及蛋白水平调控等，而其mRNA水平的表观遗传修饰调控目前仍不清楚。最新研究发现，m6A甲基化修饰是最丰富的内部mRNA修饰，参与调控mRNA代谢的多个过程。通过CRISPR-Cas9基因筛查系统和相关数据库我们发现TNFα的合成可能受m6A甲基化修饰调控。因此我们提出科学假设：m6A mRNA甲基化修饰调控TNFα的合成，从而影响免疫稳态维持。本项目拟解决如下科学问题：（1）m6A mRNA甲基化修饰调控TNFα合成的具体生物学机制；（2）m6A mRNA甲基化修饰调控TNFα合成的生理效应。对上述问题的探究有望发现调控TNFα合成的新方式和新机制，为治疗TNFα相关重大疾病提供新策略。

RNA结合蛋白是基因表达的关键效应因子，其能够调控RNA代谢的多个方面。为了研究RNA代谢对巨噬细胞活化过程的调控作用，本项目负责人及参与人首先利用CRISPR-Cas9技术，对参与调控巨噬细胞活化过程的关键RNA结合蛋白进行高通量筛选，发现m6A甲基化酶复合物中的关键基因（Mettl3、Mettl14、Nudt21和Rbm15）显著富集在TNFα-Low的细胞群中，提示m6A对巨噬细胞活化十分重要。接下来，研究者发现在单核/巨噬细胞细胞系Raw264.7及原代巨噬细胞中敲除METTL3均可显著抑制LPS诱导的巨噬细胞活化及后续炎症因子的产生。鉴于巨噬细胞在抗感染和抗肿瘤中的重要作用，研究者对METTL3在体内巨噬细胞中的功能进行了研究，发现巨噬细胞特异性敲除METTL3的小鼠对沙门氏菌更加易感，抗肿瘤能力下降。进一步的研究发现，敲除METTL3可导致TLR信号通路的负调控应激因子IRAKM显著上调，而对其它关键的接头蛋白的表达水平没有显著影响，在METTL3缺陷的巨噬细胞中敲低IRAKM可恢复巨噬细胞炎症因子的表达。研究者利用MeRIP-seq发现，Irakm mRNA的3UTR上有显著的m6A峰，敲除METTL3后该m6A峰消失，证明Irakm是m6A的靶基因。RNA降解实验和荧光素酶报告基因实验表明，m6A主要通过影响Irakm mRNA的降解，调控TLR信号诱导的巨噬细胞活化。综上，本项目研究发现了m6A甲基化酶METTL3靶向并降解早期应激反应分子Irakm的mRNA，调控巨噬细胞活化进而影响其抗感染和肿瘤杀伤能力。该研究首次证明了METTL3介导的m6A修饰在先天性免疫应答中的重要调控作用和机制，将为潜在的癌症免疫治疗提供新策略和新靶点。