牛肌红蛋白酶解多肽稳定机理研究及其在真实性鉴别中的应用

At present, the adulteration of meat and food is mostly processed by deep processing, and animal and plant-source species need to be identified simultaneously. In this study, the digestion of peptides with bovine myoglobin were the object, the high-resolution mass spectrometry method with high-throughput and high-sensitivity as a technical means. First, considered from external factors, the influence of the key influencing factors on the abundance of bovine myoglobin polypeptide was investigated. and it was related to the physicochemical properties of peptides, revealing the behavioral rules and characteristics of enzymatically hydrolyzed peptides under processing conditions. Then, considered from internal factors, the polypeptide fingerprints of animal myoglobin and plant albumin were constructed to analyze the changes of peptide content in fingerprint profiles under different levels of different species, and the common characteristics of polypeptides with less variation were analyzed to explore the competition and inhibition of polypeptide coexistence. Finally, the confirmation of the stability mechanism and the construction of the stability evaluation system were carried out in the simulation of the authenticity system. This method can provide the basis for the selection of polypeptides that are stable and suitable for quantitative analysis, provide theoretical support for the construction of a multi-species target peptide authenticity identification technology based on high-resolution mass spectrometry, and provide reference ideas for other types of adulteration, and at the same time provide Law enforcement technical means.

当前肉类食品掺假多经深加工处理，且需同时识别多种动物、植物源性物种，本研究选择具有高通量、高灵敏度的高分辨质谱方法作为技术手段，以牛肌红蛋白酶解多肽作为分析对象，首先从外部因素出发，考察加工过程中的关键影响因素对牛肌红蛋白酶解多肽丰度的影响，同时和多肽物化性质相关联，揭示加工条件下酶解多肽的行为规律及特点，阐明多肽在加工环节中稳定性的受控机制；再次从内部因素考虑，通过构建动物肌红蛋白和植物白蛋白的多肽指纹图谱，分析不同物种不同含量水平条件下指纹图谱中多肽含量变化，针对差异变化较小的多肽分析其共有特征，探讨多肽共存下的竞争、抑制相互关系；最后在模拟真实性体系中开展稳定性机理确证以及稳定性评价体系的构建，为选择稳定性强、适宜开展定量分析的多肽选择提供依据，为构建基于高分辨质谱技术的多物种靶标多肽真实性鉴别技术提供理论支撑，并为其他类别的掺假提供借鉴思路，同时为监管执法提供技术手段。

肉类食品是人们动物蛋白质的主要来源，肉类掺假欺诈已为肉类食品安全带来新的挑战。本项目围绕质谱技术开展肉类食品真实性鉴别中存在的问题，多肽稳定性的影响因素以及靶标多肽和其他多肽共存的竞争抑制关系开展系统的研究。.本项目选择代表性较强的牛靶标多肽，首先围绕加工环节的关键影响因素从加热方式、加热时间、添加剂、辅料和金属离子五个维度开展酶解多肽受热的行为规律研究，确立目标蛋白及多肽丰度在加工环节的关键影响因素主要包括加热方式、氯化钠和Mg2+浓度，而在生肉中具有较高丰度的多肽在深加工制品中其受影响的程度明显减弱。.其次，本研究首次将多肽指纹图谱分析方法与质谱真实性鉴别技术相关联，分析不同物种不同含量水平条件下多肽指纹图谱含量变化，通过构建的二元体系及多元体系分析，结果发现低含量情况下，多肽更容易受基质影响，回收率偏差变大，中、高混合比例的相对定量多肽的回收率均相对集中于60-130%。大部分的靶标多肽与其他物种多肽共存模式下存在竞争关系，但仍然有少量的多肽，可利用不同物种之间的相对含量与多肽峰面积比值进行相对定量分析，获得满足方法要求定量结果，同时还可避免蛋白质提取效率、酶活性、仪器状态、加工工艺等不确定性因素的变化而造成与真实值之间的差异。.最后，本研究充分发挥多元统计分析化学计量工具的优势，将LC-MS/MS与OPLS-DA技术相结合构建肉制品特异性定量多肽筛选体系，该方法可以大大提高特异性定量多肽的筛选效率，可以为筛选定量多肽提供依据，为后续开展多物种量化关系研究，解决定量难点打下基础。最终在不同牛肉含量的牛肉样品中筛选了3条定量多肽，可作为深度加工肉类中检测牛肉的定量多肽。肉类含量的绝对定量研究是该领域发展的延伸和方向，本研究为肉类含量研究提供了理论依据和技术参考。.本项目共发表EI收录论文4篇，申请专利1篇，培养了1名正高，1名高工，2名工程师，在基础研究和人才培养等方面都为后续该领域的研究做了良好的铺垫。