一个植物MYB转录因子调节E2F转录激活活性的机制

The development of multicellular organisms requires perfect coordination between cell division and cell differentiation. How this coordination is achieved, and the mechanisms by which developmental regulators talk to central cell cycle components (e.g. E2F) are key questions in biology today. The Arabidopsis stoma is a pore, and is formed by a pair of guard cells (GCs) derived by a single symmetric division, from a guard mother cell (GMC). The MYB factor FOUR LIPS (FLP) restricts the GMC symmetrical division by binding to DNA regulatory sequences and repressing transcription of key E2F targets. FLP is alternatively spliced, and we recently discovered that the FLP isoform (FLPL) with an extra exon (E11) does not bind DNA, but physically interacts with E2F proteins, promoting their degradation. E11 bares structural similarities with murine p19ARF, suggesting a conserved mechanism for E2F protein regulation. However, thus far, the molecular mechanisms of FLPL in regulating the transcriptional activity of E2F are largely unknown. In this proposal, flp mutants will be used to characterize the FLPL-E2F interaction, to investigate how FLPS/L modulates E2F-dependent cell cycle activation synergistically, and to understand how FLPL promotes E2F degradation. This study will permit us to gain novel understanding of the MYB-E2F interplay in cell cycle progression, with important consequences to development of multi-cellular organisms.

多细胞生物的发育由细胞分裂和分化过程完美协调。这种协调是如何获得的，以及发育调节因子如何作用细胞周期中枢组件(如E2F)的分子机制是生物学研究的关键问题。拟南芥气孔由一个保卫母细胞经一次对称分裂形成的两个保卫细胞围成。MYB转录因子FLP通过结合E2F关键靶基因的启动子区域抑制其转录，进而约束保卫母细胞的对称分裂。我们发现FLP有两种剪切形式，带有一个额外外显子(E11)的FLPL不能结合DNA，但能够与E2F蛋白相互作用，促进其降解。E11与小鼠p19ARF结构相似，提示动植物中对E2F的调节机制可能是保守的，但分子机制尚不清楚。本研究将以flp突变体为切入点，解析FLPL-E2F的相互作用，探究FLPS/L协同调控E2F依赖的细胞周期激活的调控和研究FLPL促进E2F降解的分子机制。对FLPL-E2F在细胞周期进程中的相互作用机制的创新性地理解，将为多细胞生物体的发育研究提供重要理论支撑。

多细胞生物的发育由细胞分裂和分化过程完美协调。这种协调是如何获得的，以及发育调节因子作用细胞周期中枢组件(如E2F)的分子机制是生物学研究的关键问题。拟南芥气孔由一个保卫母细胞经一次对称分裂形成的两个保卫细胞围成。MYB转录因子FLP通过结合E2F关键靶基因的启动子区域抑制其转录，进而约束保卫母细胞的对称分裂。我们发现FLP有两种剪切形式。FLP剪切变体FLPL(long)，如FLPS (short)一样也能够部分互补flp myb88双突变体的表型。虽然带有E11结构域的FLPL不能像FLPS一样直接结合DNA，但能够与E2Fa转录激活因子发生蛋白相互作用，促进这一重要的细胞周期激活因子的降解。亚细胞定位分析显示FLPL定位于细胞核中。酵母双杂交实验分析表明，E11结构域对FLPL-E2Fa的相互作用是必不可少的。利用激光共聚焦显微术，对遗传材料WT/pE2F:E2Fa-GFP和flp myb88 /pE2F:E2Fa-GFP的分析表明：与前人的报道一致，在野生型植株的成熟气孔中检测不到E2Fa-GFP 的荧光信号，与此相反，flp myb88 突变体成熟气孔保卫细胞中仍有E2Fa-GFP 表达，进一步说明FLPL 的功能是在保卫细胞成熟时，促进E2Fa 的降解。 ChIP-seq鉴定到了12个受FLPS，FLPL和E2F共同调控的靶基因，尽管ChIP-PCR表明，FLPL有结合基因启动子区的活性，但酵母单杂交分析显示FLPL不具备直接结合靶基因启动子区的活性，说明在植物体内FLPL通过E2F等其他DNA结合蛋白间接结合到DNA上。以FLPL为诱饵蛋白的酵母文库筛选，获得了三个泛素降解途径的蛋白，从另一个角度说明，在体内FLPL通过泛素化途径促进E2F的降解。我们的研究结果揭示了FLPS和FLPL在从GMC到GC的转换过程中协同工作，以两种截然不同的方式调控E2Fa转录激活因子的活性，约束GMC分裂并且只分裂一次，从而保证在拟南芥野生型植株中成熟的气孔仅含有一对保卫细胞的分子机制。FLPS通过竞争结合干扰E2Fs的DNA结合活性；而FLPL与E2F发生直接蛋白质相互作用，促进这些转录激活子降解。对FLPL-E2F在细胞周期进程中的相互作用机制的创新性地理解，为多细胞生物体的发育研究提供重要理论支撑。