miR444对水稻株高和耐低温性的调控

植物microRNA影响到个体发育的多个方面，根据生物信息学分析和本课题组的芯片杂交结果，筛选到水稻中与低温胁迫相关的miR444基因，转基因水稻材料的初步观察发现植株矮化等表型。本工作将在此基础之上，通过正反向遗传学的手段，利用miR444转基因材料、miR444靶基因的突变体材料以及靶基因的转基因材料，研究miR444对其靶基因的调节、对环境因素的应答、与非生物胁迫的关系以及如何控制植株的形态建成。通过本工作将阐明miR444在控制水稻株型发育中的作用，了解其靶基因发挥作用的分子机理。

OsMADS57是miR444a的靶基因之一，也与低温胁迫相关。从水稻突变体入手，通过Southern杂交、基因组PCR和cDNA测序对T-DNA插入突变体osmads57进行鉴定。结果表明在osmads57中T-DNA插入到OsMADS57的第七个外显子中，而且OsMADS57 ORF的3’端有75bp被来自T-DNA的24bp所替代从而形成长度为675bp的重组ORF；半定量RT-PCR和qPCR结果表明该转录本的表达量明显增加而其附近其它基因的表达未受到影响；转录活性检测表明该蛋白仍然能行使全长OsMADS57的功能。.表型观察发现osmads57分蘖增多，OsMADS57超表达植株也出现分蘖增多的表型，而OsMADS57反义植株的分蘖数少于野生型。进一步通过miR444a超表达方法证明：miR444a超表达降低了OsMADS57的转录本表达，引起miR444a超表达植株与OsMADS57反义植株类似表型。上述结果说明OsMADS57的积累引起水稻分蘖数增加。.qPCR和RNA原位杂交结果显示OsMADS57的转录本主要集中在幼叶、顶端分生组织和侧生芽中；将GFP-OsMADS57质粒在拟南芥和水稻原生质体中瞬时表达，观察发现OsMADS57主要定位于细胞核；转酵母实验表明OsMADS57没有自身激活作用，拟南芥瞬时表达分析表明OsMADS57具有转录抑制活性，酵母双杂交表明OsMADS57可以形成同源二聚体。表明OsMADS57主要在侧生芽等组织中表达，定位于细胞核，以复合体形式发挥转录抑制作用。.通过全基因组芯片杂交及生物信息学分析，发现在D14等基因启动子区域有OsMADS57可识别顺式作用元件；凝胶阻滞实验、酵母单杂交验证和转基因原生质体的荧光素酶活性测定证明D14是OsMADS57的直接靶基因；qPCR和RNA原位杂交结果显示在osmads57顶端分生组织和侧生芽中D14的表达量下调；酵母双杂交和Co-IP实验显示OsMADS57可与影响分蘖的负调控因子OsTB1相互作用；转基因原生质体的荧光素酶活性测定证明：OsTB1与OsMADS57的相互作用可以削弱OsMADS57对其靶基因D14的抑制效率；外施抑制分蘖的激素独脚金内酯，发现osmads57对该激素敏感性降低。说明OsMADS57和OsTB1共同调节D14的表达，参与对独脚金内酯的应答。