猪细小病毒NS1蛋白通过激活NF-κB信号通路调控炎性应答的研究

Porcine parvovirus (PPV) is one of the major cause of reproductive failure in swine and has high chance to coinfection with other pathogens, which caused significant economic damage on the pig production. Our previous work showed that PPV and its nonstructural protein NS1 could active the nuclear factor kappa B (NF-κB) to transcript and displayed the capability of promoting the inflammatory responses when PPV infected. But the exact mechanism and precise process of NF-κB signal pathway activation during the PPV infection are not clear. Therefor, this project focus on the NF-κB activationthe during PPV infection. First, we will examine the effect of PPV and NS1 on NF-κB activation when stimulated with PPV. Then use the NF-κ signal pathway that activate by NS1 as the entry point to elucidate the target mechanism. And finally, we will identify the effect domain responsible for the regulation of inflammatory response of NS1 protein. This project will unveil the mechanism of regulation of inflammatory response of PPV in different levels, and help to help to understand the pathogenesis of PPV. This work may also help to develop PPV preventive and therapeutic strategies.

猪细小病毒（PPV）是引起母猪繁殖障碍为主要特征的重要病原体之一，与其它病原混合感染率极高，给养猪业造成严重危害。课题组前期研究证实PPV及其非结构蛋白NS1均能激活核转录因子（NF-κB）的转录和表达增强，并促进炎性应答反应，但对于PPV及NS1激活NF-κB信号通路的作用机制和炎性应答机制尚不清楚。据此，本项目以PPV感染激活NF-κB信号通路为主题，首先确定PPV及NS1通过激活NF-κB信号通路调控宿主细胞炎性反应的作用，然后以NS1激活NF-κB信号通路机制为切入点，探寻NS1激活NF-κB信号通路的作用靶点和机制，最后鉴定NS1发挥调控炎性反应的效应功能域。项目从多层次阐明PPV调控炎性反应的作用机制，为探索PPV的致病性、预防和治疗提供依据。

猪细小病毒（Porcine Parvovirus, PPV）是引起母猪繁殖障碍为主要特征的重要病原体之一，与其它病原混合感染率极高，给养猪业造成严重危害。本项目首先确定PPV通过激活NF-κB信号通路调控细胞炎性因子的表达。将PPV感染PK-15细胞后，利用real-time PCR技术测定宿主细胞Toll样受体以及NF-κB通路相关接头蛋白的转录时相的动态表达情况。利用荧光素酶双报告系统检测PPV感染PK-15细胞后，对NF-κB分子DNA结合能力的影响，随后Western blot依次检测PPV对p65转移情况及IκBα降解情况的影响。最后ELISA方法检测PPV感染PK-15细胞后对细胞炎性因子IL-6/IL-12/TNF-α表达的影响，以及分析这种变化与NF-κB信号通路之间的关系。同时，应用NF-κB抑制剂（BAY 11-7802）、TLR9抑制剂（E6446二盐酸盐）分析TLR9和NF-κB激活通路被抑制后，炎性因子IL-6和TNF-α表达调控情况。证实了PPV致宿主细胞炎性反应通过激活NF-κB信号通路发生作用。. 证实PPV非结构蛋白NS1通过激活NF-κB信号通路导致宿主细胞炎性反应。将PPV NS1基因克隆至pEGFP-N1载体上，转染293 T细胞后，利用 ELISA、real-time PCR技术、免疫印迹技术测定宿主Toll样受体、NF-κB通路相关接头蛋白及细胞炎性因子IL-6、TNF-α的动态表达情况。利用共聚焦显微技术、免疫印迹技术研究PPV NS1转染后对NF-κB蛋白在宿主细胞中的核移位、核质分布、与IκB结合活性的影响；同时，应用NF-κB抑制剂（BAY 11-7802）分析NF-κB通路被抑制后，炎性因子IL-6和TNF-α表达调控情况。证实了PPV NS1致宿主细胞炎性反应是通过激活NF-κB信号通路发生作用。 . 最后确定PPV NS1的效应功能域。在确定PPV NS1激活NF-κB信号通路后，通过生物信息学方法分析NS1的功能域和种属序列保守性，构建了NS1的一系列截短突变体，然后利用 ELISA、real-time PCR技术进一步验证出NS1-2通过TLR2激活NF-κB信号通路进而引起炎性因子IL-6的表达。