金线莲两种基原植物杂交障碍及其机理研究

Jinxianlian, a kind of perennial precious Chinese medical herb, belongs to the Orchidaceae family. With its widely use on the treatment of diabetes, nephritis and hepatitis, Jinxianlian is commonly honored as "the king of medicine". There're two kinds of botanical origin of Jinxianlian, they are: A. roxburghii and A. formosanus. A. roxburghii, as the main cultivars, has highly kinsenoside and other active ingredients. However, the long-term vegetative propagation and unreasonable reserving seed lead to its germplasm resources degradated, resistance reduced, yield and quality declined. A. formosanus has high yield and strong resistance, but the content of active ingredients is low. So, it's an important practical significance to select and cultivate the hybrid progeny with the high quality, high yeild and strong resistance with the cross breeding of A. roxburghii and A. formosanus. However the serious dysgenesis leads to the cross barrenness. In this project, with the technologies of fluorescence microscope, electron microscope, laser scanning confocal microscope and cDNA-SRAP, the interaction of pollen and stigma and the process of embryonic development are analyzed. The types and their formation mechanisms of hybridization barriers are revealed from the level of cell, subcellular and molecular. On this basis, strategies overcoming the barriers of hybridization can be proposed, which lays the foundation for germplasm utilization and cultivars breeding of Jinxianlian. Meanwhile, it has an important reference value to carry out some similar studies on other medicinal plants.

金线莲为兰科开唇兰属多年生名贵中药材，其基原植物主要有金线兰和台湾金线莲，广泛用于糖尿病、肾炎、急慢性肝炎等症的治疗，在民间享有"药王"的美称。但作为主栽品种的金线兰由于长期的无性繁殖以及不合理的留种，使其种性退化，抗性和产量下降；台湾金线莲虽产量高、抗性强，但金线莲苷等活性成分含量较低。因此，通过金线兰与台湾金线莲杂交，选育出品质优、产量高、抗性强的杂种后代，具有重要的现实意义。但严重的生殖障碍导致两者杂交不结实。本项目拟采用荧光、电子、激光共聚焦显微和cDNA-SRAP等技术，对杂交过程中花粉与柱头相互作用及胚胎发育等进行系统研究，从细胞、亚细胞和分子水平揭示杂交障碍类型和机理，并在此基础上提出克服杂交障碍的策略，为金线莲种质资源利用及优良品种选育奠定基础，也为其他药用植物开展类似研究提供参考。

针对金线莲杂交不结实的问题，本项目对亲本农艺性状、活性成分以及抗性进行评价，对授粉前亲本的育性、授粉后花粉与雌蕊的互作特性，以及胚珠与胚囊发育的协调性等进行研究，揭示杂交障碍类型和机理，并对幼胚拯救技术及种苗快繁技术进行优化。.（1）对金线莲不同种质农艺性状进行相关、通径和主成分分析，并对抗病性进行评价。（2）采用石蜡切片法观察金线莲大小孢子发生和雌雄配子体发育，观察花粉附着、萌发、花粉管生长与柱头胼胝质等进程，采用TTC法和过氧化物酶法测定花粉活力及寿命，用联苯胺-过氧化氢法测定柱头可授性，并对不同授粉方式的植株进行结实特征调查。（3）采用荧光显微镜、透射电镜研究花粉在柱头上的萌发过程及花粉与柱头的互作。（4）采用石蜡切片法观察尖叶型金线莲×圆叶型金线莲以及圆叶型金线莲×尖叶型金线莲杂交组合胚、胚乳和胚囊发育情况。（5）利用cDNA-SRAP技术对授粉后的子房进行连续取样，分析幼胚和胚乳细胞在发育过程中基因表达差异。（6）对金线莲幼胚拯救及种苗快繁培养基的组成，温度、光照条件进行优化。.本项目可以得到以下结论：.金线莲的胚珠倒生，双珠被，薄珠心，雌配子体发育属蓼型，成熟胚囊7细胞，大小孢子发生过程中壁上有胼胝质出现，小孢子四分体为四面体形，左右对称形，交叉形，T形，绒毡层属分泌型。花粉活力表现出先上升后下降的趋势；贮藏温度与贮藏时间对金线莲花粉活力存在显著的影响，随着贮藏时间的延长，花粉活力降低，柱头于开花当天就具有可授性，随后逐渐降低。在金线莲杂交过程中，授粉后1天，即可观察到花粉粒粘附在母本的柱头上，并可以观察到部分花粉管进入到柱头中，能够完成受精作用。合子第一次分裂为横分裂形成顶细胞和基细胞，授粉后50-55天，形成球形胚。初生胚乳核一般只分裂2-3次，形成4-8个细胞核，然后就不再发生分裂，且已形成的这4-8个细胞核随着胚的发育，在受精结束后5-15 d逐渐解体消失。受精后障碍应是金线莲杂交中结实率低的主要因素。优化获得金线莲幼胚启动培养基（1/2 MS 添加1.0 mg•L−1BA、0.2 mg•L−1 NAA）。壮苗培养基为1/2 MS 添加1.0 mg•L−1BA、1.0 mg•L−1 NAA、10％的香蕉以及1.0 g•L−1活性炭。.在本项目资助下，共发表论文13篇（其中SCI收录5篇，TOP期刊2篇），并申报国家发明专利2项，1项已获得授权。