多梳家族成员NSPc1对脑胶质瘤干细胞辐射抗性的调控作用及机制研究

Glioblastoma has a bad prognosis because of its radioresistance and relapse feature which maybe caused by proliferation and radioresistance of glioblastoma stem cells.In addition of epigenetically regulating self-renew and differentiation of stem cells, Polycomb Group (PcG)proteins also involve in DNA damage response.Nervous System Polycomb 1(NSPc1) has a specific high expression level in the early embryonic development.Our previous work shows ①NSPc1 regulates proliferation by inhibiting the transcription of p21Waf1/Cip1 and stimulates ubiquitination of H2A directly;②The expression of NSPc1 in glioblastoma is higher than normal gliocyte;③The expression of NSPc1 in nervous stem cells correlates with proliferation and differentiation;④The expression of PTEN increases and phosphorylated Akt descends if transiently knock-down NSPc1.In this project,after successfully knocking down NSPc1 gene by using lentiviral expression system in glioma stem cells,we plan to determine the role of NSPc1 in effecting DNA damage response of brain cancer stem cells,and find out the target genes regulated by NSPc1 using gene array.We hope to find how NSPc1 regulates downstream target genes ,explain the mechanism of NSPc1 involving in DNA damage response of glioma stem cells and provide new targets for glioblastoma radiotherapy.

恶性胶质瘤耐放疗、易复发、预后不良，其原因可能是胶质瘤干细胞的自我增殖及辐射抗性所造成。多梳家族成员除在干细胞自我更新与分化的表观遗传调控中发挥作用外，也参与了DNA损伤反应，其成员神经系统多梳蛋白1（NSPc1）在胚胎发育早期神经系统特异高表达。前期工作发现：①NSPc1通过抑制 p21Waf1/Cip1的转录而调控细胞增殖，直接刺激H2A泛素化；②胶质瘤中NSPc1表达明显升高；③神经干细胞中NSPc1表达水平与增殖分化相关。④瞬时敲低NSPc1引起PTEN/PI3K/Akt信号通路抑制。本项目拟利用慢病毒感染建立NSPc1稳定敲低的细胞模型，研究NSPc1在胶质瘤干细胞DNA损伤反应中的具体作用，并对DNA损伤反应中其调控的靶基因进行高通量筛查鉴定，确认胶质瘤干细胞中NSPc1下游的分子靶标，初步阐释NSPc1参与胶质瘤干细胞DNA损伤反应分子机制，为胶质瘤干细胞放射治疗提供新靶点。

恶性胶质瘤耐放疗、易复发，预后不良，其原因可能是其增殖及辐射抗性造成。多梳家族成员与肿瘤增殖及辐射抵抗密切相关。本项目旨在探究PCGF1对胶质瘤在增殖及辐射抗性方面的调控作用机制，找出其作用的生物学效应关键分子，为临床治疗提供思路。通过实验我们完成了以下这些工作：（1）利用慢病毒载体建立PCGF1基因沉默的稳定细胞系，通过MTT、克隆形成、细胞周期及凋亡检测等实验发现PCGF1基因沉默后胶质瘤增殖能力下降，凋亡增加；（2）利用IR造成DNA双链断裂的细胞损伤模型，通过克隆形成率、PFGE和Western blot等实验检测发现PCGF1基因沉默细胞DNA损伤修复能力降低；（3）为筛选PCGF1调控下游基因，通过基因表达谱芯片筛选到上调基因295个，下调基因174个，发现PTEN Signaling、HMGB1 Signaling和Colorectal Cancer Metastasis Signaling等信号通路为主要被抑制通路，benign neoplasia、growth of epithelial tissue等功能被明显抑制，证实沉默PCGF1基因可以引起Myc、CCND1和ILB1等基因下调；（4）建立PCGF1基因稳定过表达细胞系，利用蛋白质组学技术（Co-IP+质谱）挖掘PCGF1相互作用蛋白，共找到339个可能与PCGF1具有相互作用的蛋白，经过DAVID分析，按照Molecular Function、Biological Process和Cellular Component进行归类，发现PCGF1主要与细胞核内转录调控、甲基化复合物、去乙酰化酶复合物、CHD类型复合物等密切相关，通过筛选证实PCGF1与HDAC2相互作用，初步认为HDAC2是PCGF1调控Myc的关键分子；（5）构建c-Myc沉默稳定细胞系，通过IR造成DNA损伤细胞模型，发现c-Myc沉默导致DNA双链断裂修复能力下降，c-Myc沉默抑制细胞生长，c-Myc参与离子辐射诱发foci（IRIF）形成，抑制c-Myc的表达导致辐射诱发的ATM磷酸化水平降低。综上所述，我们认为胶质瘤细胞中PCGF1是通过调控Myc基因发挥调控肿瘤增殖及辐射抵抗作用，为胶质瘤的生物治疗和放射治疗提供了新靶点和新思路。