玉米重金属Cd胁迫响应基因的克隆及功能研究

植物修复用于重金属污染土壤的修复具有环境友好、成本低廉等突出优点，植物富集重金属能力的强弱对植物修复效能的高低起着关键的作用。因此，对植物富集重金属分子机制的研究是世界上的研究热点之一。本项目在已获得对重金属Cd具有良好富集功效的玉米品种的基础上，利用mRNA荧光差异显示技术，获得植株响应Cd胁迫差异表达的基因群，进而筛选并克隆玉米重金属Cd胁迫响应基因。利用获得的基因序列，合成特异性引物及TaqMan探针，通过实时荧光定量RT-PCR技术对不同胁迫条件下植株目的基因拷贝数进行精确定量，明确胁迫响应基因的表达时空。采用分子生物学技术构建原核表达载体，比较不同诱导菌在含Cd培养基上生长状况差异，阐明该基因及其产物生物学功能，为探索利用自主知识产权基因开发新型重金属超富集植物，强化植物修复效能奠定基础。

植物修复用于重金属污染土壤的修复具有环境友好、成本低廉等突出优点，植物富集重金属能力的强弱对植物修复效能的高低起着关键的作用。因此，对植物富集重金属分子机制的研究逐渐成为全球环境污染治理的研究热点之一。本研究利用具有生物量大，生长条件宽松，经济附加值高的禾谷类作物玉米作为研究样本。首先，针对39种北方常见玉米品种进行重金属镉胁迫实验，用于筛选具有较好富集作用的玉米品种。结果显示，玉米品种富有9号在镉浓度为30 mg/kg的土壤中生长状态良好，无明显的生理性病害表现，在镉浓度达到40 mg/kg的土壤中，虽然生长受到抑制，但较其他品种玉米长势良好。该品种玉米叶片富集系数EC到达0.96，显示出良好的富集重金属镉的能力和良好的抗重金属胁迫能力。进而以富有9号玉米作为胁迫处理材料，通过优化的mRNA纯化，进行mRNA差别显示 (DDRT-PCR)克隆重金属镉胁迫相应基因。通过分离差异片段并进行5`RACE，获得一条基因全长序列，其中ORF数量1个，片段长度为1203bp。以该目的基因作为模板，利用Primer express 2.0软件设计TaqMan探针及引物对，选取18S rRNA基因作为内参基因，利用实时荧光定量PCR技术对该基因在不同镉胁迫条件下拷贝数进行准确定量并比较分析。结果显示，在可耐受范围内，对照组目的基因标准拷贝数最低；随着处理组镉浓度的不断升高，目的基因的标准拷贝数也随之升高，50mM处理组目的基因标准拷贝数最高，到达7.31e-4。将目的基因全长ORF重组插入pGEX-4T-1原核表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）-plysS，在不同浓度的CdCl2 LB固体培养基中进行诱导表达并观察菌斑生长状态。结果显示，随着镉胁迫浓度的不断增加，重组菌斑的生长状态发生较明显的变化，镉胁迫浓度达到100mM时，含有目的基因的重组菌生长状态依然良好；而镉胁迫浓度提高到200mM后，重组菌生长状态受到一定抑制。由此可以推论，该实验所获得的目的基因对重金属镉胁迫具有良好的响应反应，且该基因具有一定的抗重金属镉胁迫功能。该实验成果为未来探索利用自主知识产权基因开发新型重金属超富集植物，强化植物修复效能奠定了基础。