长链非编码RNA H19诱导自噬在乳腺癌他莫昔芬耐药中的作用

Long non-coding RNAs have been proved to constitute an additional layer controlling the cellular pathophysiological process. Among them, lncRNA H19 is a critical player in many diseases, including cancer. Our previous published study has already demonstrated the critical roles of H19/SAHH/DNMT3B axis in regulating DNA methylation. Our preliminary data showed that long noncoding RNA H19 might decrease the sensitivity of Tamoxifen resistant breast cancer cell to Tamoxifen treatment. Besides, we demonstrated that H19 was involved in autophagy process via down-regulating the promoter methylation status of Beclin-1. We proposed a novel mechanism of Tamoxifen resistance: H19 decreases the sensitivity of breast cancer to Tamoxifen via down-regulating methylation status of Beclin-1 and inducing autophagy. In vitro and in vivo experiments will be utilized: (1)To investigate whether H19 is involved in Tamoxifen resistance through influencing autophagy; (2) To explore the effects of H19/SAHH/DNMT3B pathway on the promoter methylation status of Beclin-1 and autophagy; (3)To reveal the predictive value of H19 for Tamoxifen resistance. Our study aims to reveal a novel mechanism of Tamoxifen resistance, to illustrate the molecular mechanism of H19 in Tamoxifen resistance and to provide the novel biomarkers for predicting and intervention of Tamoxifen resistance.

研究发现长链非编码RNA参与调控诸多病理生理过程，然而对其认识尚处于初期阶段。其中长链非编码RNA H19已被证实在肿瘤等多种疾病中发挥重要作用，我们已发表的研究证实H19可通过H19/SAHH/DNMT3B信号通路影响DNA甲基化，进一步研究其分子机制及其临床应用的可行性具有重要意义。本项目预实验发现H19可下调自噬关键基因Beclin-1甲基化诱导自噬，从而降低乳腺癌细胞他莫昔芬耐药株对他莫昔芬的敏感性，但具体调控机制不明。本项目拟从细胞、动物和临床组织三个层面探索验证：(1)H19是否通过影响自噬参与乳腺癌他莫昔芬耐药；(2)H19/SAHH/DNMT3B信号通路是否下调Beclin-1甲基化进而影响自噬；(3)H19是否可预测他莫昔芬耐药。本项目旨在揭示一个新的乳腺癌他莫昔芬耐药机制，阐明H19在其中的作用，为乳腺癌他莫昔芬耐药的临床诊治、预后判断及药物筛选提供新的靶点。

背景：他莫昔芬耐药仍然是雌激素受体阳性乳腺癌治疗的一大挑战。近年，自噬调控异常被认为是他莫昔芬耐药的潜在机制之一。长链非编码RNA H19（lncRNA H19）参与肿瘤的发生发展，但H19在他莫昔芬耐药中的作用仍不清楚。本研究中，我们评估了H19在乳腺癌他莫昔芬耐药形成中的作用及相关机制。.研究内容：本课题采用CCK8增殖实验及平板克隆形成实验检测细胞增殖情况。采用实时荧光定量PCR检测乳腺他莫昔芬敏感或耐药组织及乳腺癌细胞系中H19的表达情况。通过敲低H19或者联合敲低H19+S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)或H19+DNA甲基化转移酶3B(DNMT3B)评估H19/SAHH/DNMT3B对细胞耐药性，自噬和Beclin1甲基化的影响。蛋白印迹实验用于检测细胞自噬。共聚焦检测自噬体及自噬溶酶体的含量。甲基化特异性PCR用于检测Beclin1启动子区甲基化情况。ChIP实验检测甲基转移酶3B（DNMT3B）与Beclin1启动子区的结合情况。临床标本及小鼠移植瘤实验用于验证H19/SAHH/DNMT3B对乳腺癌他莫昔芬耐药机制的影响。.重要研究及关键数据：本研究发现H19在他莫昔芬耐药的乳腺癌组织中表达量高于他莫昔芬敏感组织，而敲低H19可增强细胞对他莫昔芬的敏感性。此外，在他莫昔芬耐药细胞（MCF7/TAMR）中敲低H19可以显著抑制自噬。相反，敏感细胞MCF-7中过表达H19可促进自噬。在MCF7/TAMR细胞中敲低H19可增加Beclin-1启动子的甲基化程度。联合敲低H19+SAHH或H19+DNTM3B均可降低Beclin-1启动子的甲基化水平并重新激活自噬功能。染色质免疫沉淀试验进一步证明DNMT3B可以直接与Beclin-1启动子区结合，而敲低H19促进他们的结合。小鼠皮下移植瘤实验证明敲低H19可降低肿瘤组织自噬蛋白表达，提高对他莫昔芬的敏感性。.结论：本课题发现H19可通过H19/SAHH/DNMT3B通路诱导自噬，并促进乳腺癌他莫昔芬耐药，其表达水平可成为乳腺癌他莫昔芬治疗的重要指标。.科学意义：本研究阐明了一种他莫昔芬耐药的新机制，为乳腺癌他莫昔芬耐药治疗敏感性的预测和新的逆转耐药治疗靶点的开发应用提供理论依据。